Двойные линейки ДНК для изучения механизма транслокации рибосом с однонуклеотидной резолюцией

Двойной анализ правителя ДНК может обеспечить механистические идеи для рибосомы транслокации и зонд других нуклеиновой кислоты смещения. Наша двойная ДНК правителя анализа в настоящее время является единственным методом, который может объективно зондировать как вход и выход стороны мРНК в рибосомных комплексов с однонуклеотидным разрешением. Аналогичные методы применяются и для измерения силы связывания ДНК и селективности химиотерапевтических препаратов.

Визуальная демонстрация метода является хорошим шансом для нас интуитивно показать преимущества нашей техники и помочь другим исследователям в дальнейшем развивать его в более приложений. Для начала сделайте пластиковый образец скважины со стиреной полосой, сверлив куб в центре с габаритами четыре миллиметра на три миллиметра на два миллиметра. Затем, используя эпоксидную смолу, приклейте к нижней поверхности кусок стекла с биотиновым покрытием длиной около пяти миллиметров.

Добавьте в образец 20 микролитров по 0,25 миллиграмма на миллилитр стрептавидина и инкубировать при комнатной температуре в течение 40 минут. Затем промыть образец хорошо дважды с буфером TAM10. Чтобы обездвижить рибосомные комплексы без антибиотиков, сначала удалите буфер из образца хорошо, и добавить 20 микролитров 0,1 микромолярной MF-Pre или MF-Post рибосомный комплекс в образец хорошо.

Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем промыть один раз с буфером TAM10. Рибосомный комплекс теперь связывается со стрептавидином на поверхности через пятипремеченый биотин конца на мРНК. Для эксперимента с использованием антибиотиков инкубируйте девять микролитров комплекса MF-Pre одним микролитером из четырех миллимолярный неомицин, 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут.

Затем объединить в трубку 0,6 микролитров 60 микромолейных EFG, 0,8 микролитров 100 микромоляных GTP, 0,8 микролитров 100 миллимолярной ПЭП, 0,3 микролитров по 1,3 миллиграмма на миллилитр пирувате киназы, 6,43 микролитров буфера TAM10 и один микролитр из пяти миллимолярной фусидической кислоты. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем объединить две смеси, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение еще пяти минут.

Провести другие эксперименты антибиотиков аналогичным образом, с концентрациями 0,2 миллимолярского виомицина, 0,4 миллимоляра гигромицина B и 0,25 миллимолярновой фусидической кислоты. Для изменения кадра повторите инкубацию для комплексов MFNF-Pre со скользким мотивом U6A. Включить антибиотики фусидиновой кислоты плюс неомицин.

Для завершения процесса гибридизации требуется достаточно времени. Рекомендуется также использовать буфер TAM10 с фактическим один хлорид натрия моль для поддержания гомостационной системы. После инкубации хорошо удалите буфер из образца.

Добавьте 20 микролитров одного микромолярского биотинилированного зондирующего нить ДНК и инкубировать при комнатной температуре за одну ночь. Утром смойте образовав ДНК/мРНК дуплекс один раз буфером TAM10. Удалите буфер из образца хорошо.

Затем добавьте в образец 20 микролитров по 0,5 миллиграмма на миллилитр магнитных бусин с покрытием стрептавидина и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов. После этого тщательно вставьте образец хорошо в держатель, и поместите его в центрифугу, чтобы удалить свободные магнитные частицы с поверхности в 84 раза г в течение пяти минут. Включите лазер.

Затем нажмите кнопку питания. Отрегулируйте чувствительность до 500 милливольт и подождите около двух часов, чтобы разогреть и стабилизировать атомный магнитометр. Чтобы настроить атомный магнитометр, запустите программное обеспечение для управления приборами и навеяните режим перемещения двигателя в шум и положение по умолчанию до нуля.

Нажмите блокировки на передней панели. Отрегулируйте чувствительность до 200 милливольт. Отрегулируйте ток и напряжение лазера, и найти правильный пик резонанса и уровень сигнала к шуму для лучшего разрешения сигнала.

Нажмите Sweep на передней панели. Убедитесь, что соотношение амплитуды к ширине выше 0,5, а фазовое значение меньше пяти градусов с шириной менее 170 герц. Подключите выход другого усилителя блокировки SR530 к обратной связи лазера, чтобы заблокировать его частоту.

Подключите функцию генератора ATF20B для ввода квадратной волны 500 милливольт пик к пику, 100 миллигерц в качестве эталонного сигнала для преобразования тока в магнитный сигнал. Затем отключите генератор функций. Настройка режима перемещения двигателя в двухготовном и по умолчанию до 260 миллиметров.

Проверьте состояние контроллера температуры, чтобы убедиться, что температура составляет около 37 градусов по Цельсию, атомного датчика. Проверьте стабильность всей системы дважды, непосредственно запуская программу без загрузки образцов для измерения сигналов пустого держателя образца. Чтобы намагничить образцы, осторожно используйте пинцет, чтобы взять образец из держателя, и поместите на стадии намагничить в течение двух минут.

Затем положить образец обратно в держатель образца, и центрифуга в 335,4 раза г в течение 20 минут. Удалите неспецифически связанные магнитные частицы. Затем загрузите образец на двигатель пинцетом.

Нажмите Блокировка на передней панели для запуска программы. Между тем используйте пинцет, чтобы загрузить другой образец в держатель, и поместить его в центрифугу. Сделайте стеклянную сторону с покрытием лицом к центруге и начните центрифугу в 335,4 раза г в течение четырех минут.

Когда двигатель вернется к нулю, примерно через пять минут нажмите Сохранить на передней панели. Тщательно используйте пинцет для передачи одного образца от двигателя к держателю центрифуги. Нанесите более сильную силу, увеличив центробеченную скорость на 100 об/мин или аналогичный размер шага.

Обменяем образец на центрифугу. Процесс поочередно постепенно увеличить силу каждый раз. Полный спектр силы получен после 10-12 точек данных.

Когда все запланированные эксперименты будут закончены, выключите оборудование, продолжая в обратном порядке, как это было включено. Удалите образцы из держателя, и погрузить их в этанол для очистки и использования в будущем. Очистите держатель образца ацетоном в случае загрязнения магнитного шарика.

В этом протоколе, рибосомный комплекс был обездвижен на поверхности, через пять премьер конце мРНК, и сделал как пять премьер и три премьер стороны легко доступны для зондирования ДНК правителей. Когда связующее звено для пяти-премьер стороны было больше, чем 50 тимин, сильный магнитный сигнал был обнаружен, что свидетельствует об успешном образовании ДНК / мРНК дуплексов. Изменяя количество нуклеотидов в ДНК, корреляция силы диссоциации с дуплексной длиной была достигнута для трех-премьеровых и пяти-премьер сторон, соответственно.

Результаты нормальной транслокации из MF-Pre в MF-Post, в отсутствие антибиотиков, показывают, что рибосома переехала тремя нуклеотидами к трех-премьер-конец с обеих сторон. MF-Pre перевозил бродячий fMet-tRNA и фенилаланин-тРНК на участках P и A, соответственно, в то время как MF-Post перевозила fMet-tRNA и фенилаланин-тРНК на участках E и P, соответственно, с вакантным участком А. Однако, когда оба фузидиновой кислоты и адиомицин антибиотики присутствовали, рибосома переехал только один нуклеотид на пять премьер стороны, но два нуклеотидов на три премьер стороны.

После смывания антибиотиков произошла нормальная транслокация, о чем свидетельствуют три нуклеотидных движения как с пяти-премьер, так и с трех премьер-сторон. При намагничении образца поверхность с покрытием должна подойти и покинуть магнит вертикально. Удаление неспецифически связанных магнитных частиц очень важно для точности и качества данных.

Наша методика обеспечивает высокое разрешение и в целом применимый способ исследования молекулярного смещения нуклеиновой кислоты, которая широко встречается в молекулярной биологии.