Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов
2 января 2020 г.
Этот протокол описывает оригинальную установку, сочетающую спектральные и флуоресцентные измерения продолжительности жизни для оценки реж. Фюрстерской рецензии на передачу энергии (ФРЭТ) между флуоресцентными зондами на основе родамина и лигнином-полимером непосредственно в толстых участках растений.
В лигноцеллюлосной биомассе активность ферментов, анализирующих полисахариды, ограничена наличием неспецифических взаимодействий с лигнином. Анализ FRET является актуальным подходом к эволюции в наномасштабе. Получение всех разделов после может быть проблемой в зависимости от биомассы.
Не то время, делая раздел с микротомой и выполнять нежные стирки. Сопоставление флуоресцентных измерений продолжительности жизни и спектра позволяет количественно чувствительное и недвусмысленное определение FRET между молекулами лигнина и TAG на месте. Этот метод использует сложные методы, такие как выборка разделов на многомерной микроскопии приобретения и анализа, которые могут быть легко узнать с визуальной демонстрации.
Для подготовки образцов растений из дерева, пшеницы, волокон или фрагментов используйте лезвия бритвы, чтобы вырезать один сантиметр длинных образцов, не повреждая структуру материала и поместить образцы под вакуум, чтобы удалить любой воздух. Погрузив образцы в течение 24 часов в последовательных 30%и 50% концентраций ПЕГ, разбавленных в воде при комнатной температуре с нежным перемешиванием. Затем в течение 24 часов погружается в 100%-ную концентрацию ПЕГ при 70 градусах по Цельсию.
После 100%-ного погружения PEG поместите образцы в капсулы на 70-градусную по Цельсию и постепенно уменьшаем температуру пластины на пять градусов по Цельсию, пока пластина не достигнет комнатной температуры. Когда образцы остыли, используйте микротом и одноразовые лезвия, чтобы тщательно получить плоские участки толщиной от 30 до 60 микрометров от каждого блока PEG. Удалите ПЭГ из секций с тремя пятиминутными нежными промывки воды.
После последней стирки инкубировать до трех секций на трубку с 500 микролитров свежеприготовленного флуоресцентного зонда в течение 72 часов защищены от света. В конце инкубации окрашивания используйте кисть для переноса секций на слайд перед монтажом секций между стеклянной горкой и крышкой номер 1.5H. Чтобы определить ширину спектрального окна детектора sFLIM, поместите кристаллы мочевины в культурную коробку с дном стекла 0,17 микрометра и поместите коробку на держатель образца микроскопа.
Выберите цель 20X и титановый сапфировый лазер с длиной волны 900 нанометров и мощностью 2% и включите сканирование. Для выполнения измерений sFLIM переключитесь на режим sFLIM. Чтобы собрать второй гармонический сигнал на детекторе sFLIM, постепенно отрегулируйте длину волны лазерного возбуждения с 900 до 980 нанометров до тех пор, пока второй гармонический сигнал не будет собран во втором спектральном канале.
Затем определите длину спектрального окна. Переключитесь в не отсканированный режим для отправки флуоресцентных фотонов на детектор sFLIM. Установите приобретение sFLIM в режим включения, чтобы позволить фотону рассчитывать на единый фотон счетчик.
Когда прибор будет готов, поместите контроль родной пшеничной соломы только растительный раздел между слайдом и крышкой скольжения на стадии микроскопа и установить систему в непрерывный режим, чтобы лазерное сканирование. Установите 30-секундный сбор времени и убедитесь, что постоянная дискриминатор фракций составляет от одного раза 10 до четвертого и один раз от 10 до шестого. Затем выберите область измерения на примере и нажмите Кнопку «Начало».
В конце измерения сохраните файл sdt и повторите измерение, по крайней мере, еще для девяти образцов. Необходимо найти баланс между достижением достаточного количества собранных фотонов для фотона, избегая при этом скупить пульс, и индуцированными фото эффектами, которые могут изменить срок службы флорескции. Топ анализировать приобретенные данные sFLIM, импортировать родной пшеницы соломы только файлы данных в одном фотоне счетчик программного обеспечения и открыть вариант и режим, чтобы выбрать неполный Multi Exponential 12,5 наносекунд.
В соответствии с опциями и предпочтениями, выберите вычислить инструментальный ответ автоматически и выбрать экспоненциальную модель Fit. Для каждого канала примените подходящую модель и сохраните подходящие параметры в электронной таблице. Для сравнения каналов и экспериментов вычисляйте основную продолжительность жизни флуоресценции в электронной таблице.
Чтобы рассчитать средний срок службы по крайней мере 10 образцов во всех каналах, проанализируйте основной флуоресцентный срок службы на донорских каналах, чтобы определить выделенное значение канала, которое выбрало наибольшее число фотона и соответствует максимальному выбросу лигнина. Для сравнения значений sFLIM и EFRET между контрольным образцом родной пшеничной соломы и экспериментальным образцом рассмотрим положительный EFRET, связанный с однородным уменьшением продолжительности жизни между контролем и экспериментальными образцами, которые будут проанализированы как событие FRET. В этом репрезентативном эксперименте кривые sFLIM показывают некоторые изменения, которые могут быть достигнуты между эталонным образцом и двумя случаями взаимодействия.
Действительно, увеличение флуоресценции в спектральных регионах, соответствующих диапазону выбросов родамина, легко визуализируется. Тщательное наблюдение за тремя кривыми распада первого канала, также показывает более сильный перегиб для родной пшеничной соломы с Декстрин помечены родамин, чем для родной пшеничной соломы инкубируется с PEG помечены родамина. После установки кривых распада фотона и расчета основного времени жизни каждого канала флуоресценции, подпись FRET становится более очевидной.
Например, в то время как время жизни флуоресценции альтернативно увеличивается и уменьшается вдоль спектра флуоресценции для родного образца пшеничной соломы, четкая подпись FRET наблюдается как для местных разделов пшеничной соломы, инкубированных PEG, помеченных роданом и родной пшеничной соломой с Декстрином, помеченным образцами родана. В контексте ингноцеллюлозного гидролиза биомассы этот метод можно легко перенести на исследования ферментного взаимодействия в различных образцах биомассы, требующих строгой характеристики каждой новой биомассы. Так как sFLIM не требует фиксации образца, он прокладывает путь для динамических исследований взаимодействия фермента лигнина и, вероятно, будет направлять стратегии ферментной инженерии и предварительное лечение биомассы.
Как и в большинстве случаев, измерения времени жизни требуют использования импульсных инфракрасных лазерных источников. Соответствующие меры предосторожности должны быть приняты соответствующим образом.
Обзор
В данном протоколе описывается новый подход, сочетающий спектральные измерения и измерения времени жизни флуоресценции для оценки ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) между флуоресцентными зондами на основе родамина и лигнином в толстых срезах растений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Биология растений
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретическая часть
- Лигноцеллюлозная биомасса создает определенные трудности из-за неспецифических взаимодействий с лигнином.
- FRET-анализ полезен для изучения взаимодействий на наноразмерном уровне.
- Подготовка и секционирование образцов имеют решающее значение для точности измерений.
- Измерения времени жизни флуоресценции позволяют получить представление о молекулярных взаимодействиях.
Цель исследования
- Разработать метод оценки FRET между лигнином и флуоресцентными зондами in situ.
- Обеспечить возможность изучения взаимодействия ферментов в различных образцах биомассы.
- Углубить понимание динамики взаимодействий между ферментами и лигнином.
Используемые методы
- Подготовка образцов, включающая инфильтрацию ПЭГ и микротомирование.
- Инкубация с флуоресцентными зондами для FRET-анализа.
- Использование sFLIM для спектральных измерений и определения времени жизни флуоресценции.
- Анализ данных с использованием моделей аппроксимации для определения времени жизни флуоресценции.
Основные результаты
- Наблюдаются четкие признаки FRET между лигнином и образцами с меченой родаминином.
- Вариации времени жизни флуоресценции указывают на успешное протекание событий FRET.
- Метод позволяет проводить сравнительный анализ контрольных и экспериментальных образцов.
- Получены данные о взаимодействии ферментов с лигноцеллюлозной биомассой.
Выводы
- Разработанный метод эффективен для изучения взаимодействий фермента с лигнином.
- Динамические исследования возможны без фиксации образца.
- Данный подход может быть использован для оптимизации ферментной инженерии и стратегий предварительной обработки биомассы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Неспецифические взаимодействия между ферментами и лигнином ограничивают эффективность гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, создавая «узкое место» в производстве биотоплива и биохимикатов. Количественная оценка этих взаимодействий с помощью FRET на основе sFLIM обеспечивает механистическое снижение рисков при инженерии ферментов и оптимизации предварительной обработки. Это позволяет с высокой степенью достоверности осуществлять прогноз при валидации мишеней и поиске наиболее перспективных биомассоразлагающих ферментов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем измерения аффинности связывания фермента с лигнином в нативных растительных матрицах.
- Практическая ценность: Обеспечение функциональной валидации мишеней с помощью количественных FRET-сигнатур без экзогенного мечения лигнина.
- Прогностическая ценность: Поддержка приоритизации портфеля за счет идентификации вариантов ферментов с пониженным уровнем неспецифических взаимодействий с лигнином.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных срезов растений для высокочувствительного скрининга взаимодействий флуоресцентного зонда с лигнином.
- Воспроизводимость: Стандартизация спектральных измерений и измерений времени жизни для обеспечения стабильного детектирования FRET в различных типах биомассы.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности повторного использования платформы для сравнительного анализа ферментативных кандидатов в контролируемых условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между данными о взаимодействиях на этапе поиска и доклинической оценкой эффективности ферментов с комплексными субстратами.
- Сопоставление биомаркеров: коррелирует сдвиги времени жизни флуоресценции с функциональными событиями связывания фермента с лигнином.
- Продвижение с учетом рисков: обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований за счет снижения неопределенности механизмов в путях гидролиза.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, обеспечивая количественную оценку взаимодействий фермент-лигнин до этапа оптимизации соединений-лидеров, что способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической уверенности при выборе кандидатов в ферменты.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о специфичности ферментов путем количественного измерения FRET между лигнином и зондами с родамиминовой меткой in situ.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу срезы растений со стандартизированным сбором данных sFLIM для надежной оценки взаимодействия соединений с ферментами.
- Аналитика: Формирует данные о времени жизни флуоресценции и спектральные показатели, позволяющие сравнивать силу взаимодействия различных вариантов ферментов.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о молекулярных взаимодействиях с доклиническими этапами, определяя стратегии инженерии ферментов для улучшения гидролиза биомассы.
- Прикладное использование: Создает воспроизводимую методику скрининга взаимодействий с лигнином для различных видов сырья биомассы и библиотек ферментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в процессах взаимодействия фермента с лигнином за счет прямых измерений на наноразмерном уровне.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость посредством коррелированного спектрального имиджинга и имиджинга времени жизни.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейших исследований («go/no-go»), предоставляя количественные данные о взаимодействиях для экономически эффективного скрининга ферментов.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов в ферменты с учетом рисков на основе профилей их взаимодействия с лигнином.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области визуализации времени жизни флуоресценции и спектрального анализа для точной интерпретации данных sFLIM.
- Метод зависит от наличия импульсных инфракрасных лазерных источников и инфраструктуры однофотонного счета для измерения времени жизни.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов, инфильтрации ПЭГ и изготовления срезов.
- Требуется учет особенностей адаптации в связи с различиями в автофлуоресценции лигнина для разных типов биомассы, таких как древесина, пшеница и волокна.
- Включает практические ограничения, связанные с управлением фотонным бюджетом для предотвращения наложения импульсов и появления фотоиндуцированных артефактов во время сбора данных.
