Активированный перекрестный связаны Агароуз для быстрого развития аффинити Хроматография resins - Захват антител как пример
August 16th, 2019
В этой процедуре, DsRed основе эпитопа лиганд обездвижен для получения весьма селективной смолы сродства для захвата моноклональных антител из сырой растительных экстрактов или клеточной культуры супернатантов, в качестве альтернативы белка А.
Моноклональные антитела доминируют на биофармацевтическом рынке и, как правило, очищаются хроматографией белка А. Согласно смолы является одним из основных драйверов затрат во время производства, влияющих на цену антител на основе терапии. Здесь мы описываем новый лиганд сродства на основе флуоресцентного белка, который читается как носитель линейного эпитопа нейтрализующих антитела 2F5.
В целом наш метод позволяет быстрое поколение сродства хроматографических смол, которые могут быть использованы для захвата моноклональных антител. Мы продемонстрировали эту способность, захватив антитела 2F5 из экстракта сырого растения. Мы оптимизировали условия захвата и буфер раствора для улучшения динамической емкости связывания и повторного использования смолы.
Наша смола позволяет, как правило, слабее условия, чем белок А и имеет потенциал, чтобы уменьшить затраты на очистку моноклональных антител. Кроме того, смола может быть легко адаптирована к другим антителам, которые связываются с линейными эпитопами. Чтобы начать эту процедуру, отрегулируйте концентрацию подготовленного раствора лиганда сродства так, чтобы он был в диапазоне от 5 до 15 граммов на литр, как это определено конструкцией экспериментов.
Храните раствор на льду до тех пор, пока не будет готова реакция соединения. Затем заполните один двухми миллилитровый шприц раствором DFE. И подготовить адаптер для установки шприцев на NHS-активированных перекрестных столбцов агарозы с объемом кровати одного миллилитра.
На каждые 10 столбцов, используемых для соединения, приготовьте 30 миллилитров раствора деактивации, 30 миллилитров раствора низкого рН и один миллилитр раствора для хранения. Затем приготовьте 20 миллилитров одной миллимолярной соляной кислоты в трубке. И инкубировать его на льду, по крайней мере 20 минут.
Подготовьте точность шкалы для мониторинга потока через фракции для всех шагов во время реакции соединения. После этого откройте запечатанную колонку агарозы, активированную ГСЗ. Нанесите каплю буфера на вход адаптера, чтобы предотвратить проникновение воздуха в столбец.
Намонтировать адаптер шприца на входе колонки. Вымойте колонку шестью миллилитров ледяной одной миллимолярной соляной кислоты, при скорости потока меньше, чем один миллилитр в минуту. Используя двухми миллилитровый шприц, немедленно ввимите 1,5 миллилитров раствора DFE со скоростью потока менее одного миллилитра в минуту.
И собирать поток через фракцию по точной шкале для последующего анализа. Печать колонны на обоих концах и инкубировать в течение 15 до 45 минут, при 22 градусах по Цельсию. Далее вводят шесть миллилитров раствора активации, за которыми следуют шесть миллилитров раствора низкого рН, при скорости потока менее одного миллилитра в минуту, удаляем из смолы нековалентно связанные лиганды.
Ввесите шесть миллилитров раствора активации и инкубировать столбец в течение 15 минут. После этого ввилите в колонку шесть миллилитров раствора низкого рН. Затем шесть миллилитров раствора активации.
Затем ввимит в колонку еще шесть миллилитров раствора низкого рН. Ввеси два миллилитров раствора для хранения в колонку и храните его при четырех градусах Цельсия. Сначала подготовь 100 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, содержащего 2F5, либо супернатанта для предпочтительной клеточной системы выражения, которая также содержит 2F5.
Далее подготовьтесь к равновесию буфера и буфера иллюзии высокой прочности железа X, как указано в текстовом протоколе. Промыть хроматографическую систему буферами. Накреню столбец сродства DFE на хроматографической системе.
И эквилибрировать с пятью резюме эквилибрации буфера, со скоростью потока один миллилитр в минуту. Мониторинг поглощения УФ на 280 нанометров. Затем загрузите 80 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, либо супернатанта на столбец со скоростью потока 5 миллилитров в минуту.
Чтобы гарантировать время контакта в две минуты. Соберите поток через образцы в двух миллилитров фракций или прорыв кривой реконструкции. Храните поток через образцы при четырех градусах по Цельсию, если немедленный анализ выборки не возможен.
После этого мыть столбец с 6CV эквилибрации буфера. Соберите образец в начале, середине и конце стирки. Разбавить MAB2F5 с пятью томами высокой ионной прочности иллюзионный буфер.
Соберите фракцию DFE, когда УФ-сигнал на 280 нанометров увеличился до пяти миллиа абсорбционных единиц выше базового уровня. Оптимизируйте буфер иллюзии для каждой пары эпитоп-антител, как указано в текстовом протоколе. Синтез белка DFE выражается в трансгенных табачных растениях, выращенных в теплице.
Общее восстановление DFE составляет 23,5 миллиграмма на килограмм. С чистотой более 90%Абсолютное количество DFE обездвижено на смоле увеличивается с массой DFE вводят в колонку, и плато около 15 граммов на литр, в то время как соединение выход снижается непрерывно, как больше DFE вводится. Молекулы DFE, как видно, сохраняют свою красную флуоресцентность, даже после соединения.
Интенсивность цвета соответствует общему количеству обездвижено DFE. Поэтому цвет столбца может быть использован в качестве простого параметра контроля качества для оценки эффективности соединения и качества столбца. Рекомбинантное антитело 2F5 преходяще произведено в заводах benthamiana Nicotiana выращенных в phytotron.
Улавливание 2F5 из экстракта сырого растения, проверяется с помощью столбцов сродства, в сочетании с приблизительно семью миллиграммами очищенного DFE. Концентрация хлорида магния 1,25 моляра достаточно, чтобы elute 2F5 из смолы сродства DFE с восстановлением близко к 100% и чистота примерно 97%, что сопоставимо с белка смолы. DBC смолы сродства DFE на 10%2F5 прорыв, снижается линейно в течение 25 циклов, около 15% от первоначального значения.
Мы использовали подход к экспериментам для оптимизации емкости соединения нашего лиганда сродства. Эти условия могут быть доработаны для других лигандов в будущем. Наш метод использует флуоресцентный белок, чтобы нить суб-носителя белка для продукта конкретных лиганд.
В то же время просто добавьте функции в качестве визуального индикатора качества мобилизационной процедуры, обеспечивая немедленную и интуитивную обратную связь с оператором.
Обзор
В данном исследовании представлен новый аффинный резин на основе DsRed для селективного захвата моноклональных антител из сырых растительных экстрактов или супернатантов клеточной культуры. Метод направлен на снижение затрат на очистку по сравнению с традиционной хроматографией на Protein A.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Очистка белков
- Моноклональные антитела
Бэкграунд
- Моноклональные антитела играют важную роль в биофармацевтике.
- Хроматография на Protein A является распространенным, но дорогостоящим методом очистки.
- Необходимы новые методы для снижения производственных затрат.
- Флуоресцентные белки могут быть использованы для аффинной хроматографии.
Цель исследования
- Разработать альтернативный аффинный резин для очистки моноклональных антител.
- Оптимизировать условия захвата для улучшения связывающей способности.
- Продемонстрировать приспособляемость резина для различных антител.
Используемые методы
- Приготовление раствора аффинного лиганда на основе DsRed.
- Связка лиганда с колонками NHS-активированного агароза.
- Тестирование резина с очищенными растительными экстрактами, содержащими антитела.
- Мониторинг УФ-поглощения на этапах очистки.
Основные результаты
- Новый резин позволяет эффективно захватывать антитела с высокой чистотой.
- Для протестированных антител были достигнуты показатели восстановления почти на 100%.
- Резин продемонстрировал лучшую повторную используемость по сравнению с Protein A.
- Эффективность связывания может быть визуально контролирование через флуоресценцию.
Выводы
- Резин на основе DsRed является многообещающей альтернативой для очистки антител.
- Он может потенциально снизить затраты в производстве биофармацевтики.
- Будущие адаптации для других антител возможны.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Protein A chromatography remains a major cost driver in monoclonal antibody purification, impacting the affordability of biologics. This method presents a cost-effective alternative using a DsRed-based affinity ligand immobilized on activated cross-linked agarose, enabling selective capture of antibodies with linear epitopes from crude extracts. The approach supports early-stage target validation and assay development by providing a reusable, visually quantifiable resin system that reduces reliance on expensive ligands.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through selective capture of epitope-specific antibodies from complex mixtures.
- Operational Value: Supports biological de-risking by validating target engagement using a linear epitope ligand expressed in plant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized affinity matrix for quantitative measurement of antibody binding in crude extracts.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through fluorescence-based coupling efficiency monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by allowing purification of functional antibodies from disease-relevant expression systems.
- Operational Value: Supports predictive confidence in lead identification through consistent recovery and purity across multiple cycles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, offering a platform for rapid resin generation applicable to multiple antibody targets with linear epitopes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of specific antibodies from complex biological samples.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via UV absorbance monitoring and fluorescence-coupled ligand quantification.
- Analytics: Provides measurable readouts such as dynamic binding capacity and recovery rates to compare purification conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by producing purified antibodies suitable for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for rapid adaptation to new antibody targets through ligand exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in antibody-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of resin production using design-of-experiments optimization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early purification feasibility.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on achievable purity and recovery metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, purification, and conjugation chemistry.
- Needs instrumentation for flow-controlled coupling, UV monitoring, and fraction collection.
- Demands cross-team standardization of ligand concentration, buffer conditions, and coupling timelines.
- Involves adaptation considerations for different epitope-antibody pairs, particularly in optimizing elution buffers.
- Includes practical limitations such as ligand leaching over cycles and declining dynamic binding capacity with reuse.
