ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана частично за счет финансирования, предоставляемого Novartis Pharmaceuticals через исследовательский альянс с Университетом Пенсильвании (Майкл К. Милоне), а также Санкт-Болдрик Фонд Стипендиат премии (Саба Ghassemi).

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь мы описываем подходы к измерению функции и эффективности CAR Т-клеток, собранных с разными интервалами всей культуры ex vivo. Наши методы обеспечивают всестороннее понимание анализов, предназначенных для оценки пролиферативной способности, а также функции эффектора in vitro. Мы описываем, как измерить активность CAR T клеток после стимуляции через CAR и подробно ксенотрансплантата модели лейкемии с использованием CAR Т-клеток, собранных в день 3 против 9 их стадии логарифмического расширения.
<p class="jove_con...

Химерные рецепторы антигена (ЦАР) обеспечивают перспективный подход к перенаправлению Т-клеток против различных опухолевых антигенов. CARs синтетические рецепторы, которые связывают антиген цели. Хотя их точный состав является переменным, CARs обычно содержат 3 различных домена. Внеклеточный домен направляет привязку к целевому антигену и, как правило, состоит из одного фрагмента цепных антител, связанных с CAR через внеклеточный шарнир. Второй домен, обычно полученный из цепочки CD3 и комплекса Рецепторов Т-клеток (TCR), способствует активации Т-клеток после участия в CAR. Третий costimulatory домен включен для повышения функции Т-клеток, прививаемость, метаболизм, и настойчивость. Успех Т-клеточной терапии CAR в различных гематопоитических злокачественных новообразований, включая B-клеток острого лимфобластного лейкоза (ВСЕ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и множественной миеломы подчеркивает терапевтическое обещание этого подхода1,2,3,4,5,6. Недавнее Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами (FDA) утверждения для двух CD19 конкретных CAR T клеточной терапии, tisagenlecleucel для педиатрических и молодых взрослых ВСЕ и axicabtagene ciloleucel для диффузной большой B-клеточной лимфомы, усиливает перевод по заслугам CAR T клеточной терапии.
Подходы, основанные на Т, включают изоляцию Т-клеток от периферической крови, активацию, генетическую модификацию и расширение ex vivo. Дифференциация является важным параметром, регулирующим эффективность CAR Т-клеток. Соответственно, ограничение дифференциации Т-клеток во время культуры ex vivo повышает способность инфляции, расширения и упорства, обеспечивая долгосрочную иммунонадзор после приемной передачи2,7,9. Т-клетки состоят из нескольких различных подмножеств, включая: наивные Т-клетки (Tn), центральную память (Tcm), эм, эффектор дифференцированный (Tte) и память стволовых клеток (Tscm). Эффектор дифференцированных Т-клеток имеют мощные цитолитические способности; однако, они недолговечны и прививают плох10,11,12. В отличие от этого, Т-клетки с менее дифференцированным фенотипом, включая наивные Т-клетки и Ткм, обладают превосходными прививочными и пролиферативными способностями после передачи приемных клеток13,14,15,16,17,18. Состав собранных Т-клеток в предизготовленный продукт может варьироваться в разных пациентах и коррелирует с терапевтическим потенциалом Т-клеток CAR. Доля Т-клеток с наивным иммунофенотипом в стартовом аферезе сильно коррелирует как с прививкой, так и с клинической реакцией19.
Продолжительность культуры является важным параметром, влияющим на дифференциацию в Т-клетках CAR, подготовленных для приемной передачи. Недавно мы разработали подход к созданию высококачественных CAR T-клеток с использованием сокращенной парадигмы культуры20. Используя наш подход, мы показали, что ограниченная культура приводит к CAR Т-клеток с превосходной функцией эффектора и настойчивость после принятия передачи в ксенотрансплантата моделей лейкемии. Здесь мы представляем подходы к надежно генерировать CART19 клеток (автологические Т-клетки инженерии, чтобы выразить анти-CD19 scFv прилагается к CD3 и 4-1BB сигнализации доменов) и включают подробное описание анализов, которые обеспечивают понимание биоактивности CAR T и эффективность до принятия передачи.

<table><tbody><tr><td>Анти CD3/CD28 динабет</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Мышь против человека CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Мышиное антитело к человеку CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Лизирующий раствор 10X Концентрат</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Абсолютные счетные пробирки</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 античеловеческое антитело к CD4</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 античеловеческое антитело к CD3</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSE</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen</td><td></td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Антитело</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Мышиный античеловеческий CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Сыворотка AB человека</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, премиум класс</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-глутамин</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Счетчик жидкого сцинтилляции, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Фиксируемые фиолетовые</td><td>молекулярные зонды</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter</td><td>Counter Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Синее антитело против человеческого CD14</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Тихоокеанское голубое антитело против человеческого CD19</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE против человеческого CD45RO Антитело</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 против человеческого CD95 (Fas) Антитело</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 против человеческого антитела CD27 Beckman</td><td> Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Фенол свободный от красных сред</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Люциферин - K+ Соль</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

Производство химерных антигенных рецепторов (car) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Приемная иммунотерапия обещает лечение рака и инфекционных заболеваний. Мы описываем простой подход к преобразовыванию первичных т-клеток человека с химерным рецептором антигена (CAR) и расширить их потомство ex vivo. Мы включаем анализы для измерения экспрессии ЦАР, а также дифференциации, пролиферативной способности и цитолитической активности. Мы описываем анализы для измерения производства цитокинов эффектора и воспалительной секреции цитокинов в т-клеток CAR. Наш подход обеспечивает надежный и комплексный метод культуры Т-клеток CAR для доклинических моделей приемной иммунотерапии.

Используя описанные выше методы, мы стимулировали и расширяли Т-клетки в течение 3 или 9 дней(рисунок 1A,B). Мы также проанализировали их профиль дифференциации, о чем свидетельствует стратегия gating, изложенная на рисунке 1C,путем измерения изобилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Мы показываем прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора с течением времени во время культуры ex vivo<strong...

Мы описываем подход к надежно генерировать химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток и проверить их дифференциации и функции в пробирке и in vivo.

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Де-lib-er-ating продукт CAR T Cell с функциональной компетентностью, которая размножается, размножается и имеет цит-эль-уриховую активность после инфузии, является ключевым компонентом эффективной приемной иммунотерапии. Например, при твердых опухолях Т-клеток ЦАР они могут проникать в твердые опухоли и получать оптимальную стимуляцию антигена; однако, их общая притяжение и пролиферация затруднены у людей. Основным преимуществом этого подхода является то, что он может сохранить качество Т-клеток ЦАР или состояние дифференциации Т-клеток ЦАР без генерации неизлечимо дифференцированных или исчерпанных Т-клеток, что уменьшило бы пролиферативную способность или плохую эффективную функцию после вливания.Этот метод может быть трудным, потому что Т-клетки очень чувствительны к их концентрации клеток или площади поверхности сосудов, что их культурные дюйма А также их метаболические потребности. По существу Т-клетки должны быть счастливы на протяжении всего процесса, в противном случае они не будут расти.Для начала этой процедуры, изготовить 6-ну культуры блюда. Активируйте свежие или крио-сохраненные первичные Т-клетки человека, смешивая их с магнитными бусинами anti-CD3 CD28, в соотношении трех бусин на Т-клетку в колодцах культурных блюд. Культура Т-клеток в X-Vivo 15 среды дополняется нормальной сыворотки AB человека, L-глутамин, он-пи и IL2.Активируйте Т-клетки с концентрацией в один миллион Т-клеток на миллилитр во время расширения. И культуры их при 37 градусов по Цельсию с 20%кислорода, 5%углекислого газа и 95%влажности. После ночной стимуляции добавьте лентивирусные супернатанты в активированные Т-клетки.Рассчитайте объем супернатантов, необходимых для достижения множественности инфекции от трех до пяти. Продолжайте культивирование клеток, используя те же условия. На третий день соберите репрезентативную алициту клеток криосохранения.Перед криосохранения, удалить магнитные бусы, мягко пипетки и магнитного разделения. Подготовка замораживания среды, которая содержит PBS с 0,5%DMSO. И хранить его при четырех градусах по Цельсию до готовности к использованию.Далее центрифуга Т-клеток в 300 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте пять миллилитров PBS. Центрифуга клетки снова на 300 раз G в течение пяти минут и отказаться от PBS.Мы приостанавливаем пеллант в одном миллилитре холодного крио-сохранения среды. Заморозить Т-клетки в охлажденном замораживании контейнера. И хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 48 часов.После этого перенесите замороженные клетки в жидкий азот. Вымойте остальные Т-клетки один раз в пять миллилитров PBS, чтобы устранить любой остаточный вектор. Центрифуга при 300 раз G в течение пяти минут.Затем, decant PBS и повторно приостановить ячейки pellant в среде культуры Т-клеток в концентрации 500000 клеток на миллилитр. Разделите Т-клетки на две культуры, разработанные 45 и 9. Подсчитайте Т-клетки по цитометрии потока, используя подсчет бисера и моноклональных антител к человеческим CD4 и CD8.А также краситель жизнеспособности. Перекармливайте культуры через день, чтобы поддерживать их в концентрации 500 000 клеток на миллилитр. На пятый день, рассчитывать и крио-сохранить день пять культур, как описано ранее.На седьмой день вымойте 500 000 клеток в PBS. И повторно приостановить их в 100 микролитров флуоресценции активированного буфера сортировки клеток. Затем обнаружите экспрессию поверхностного белка CAR путем иммуноокрашивания флуоресцентно конъюгированных анти-CAR 19 идиотского типа по цитометрии потока.На девятый день считать и крио-сохранить день девять культур, как описано ранее. В этом исследовании измеряются функции и эффективность Т-клеток ЦАР, которые собирают с различными интервалами по всей культуре X-Vivo. Используя методы, описанные в этом видео, Т-клетки стимулируются и расширяется в течение трех или девяти дней.Профиль дифференциации клеток, как указано в стратегии gating показано здесь, анализируется путем измерения обилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора наблюдается с течением времени во время культуры X-Vivo. Затем оценивается функция эффектора и пролиферативная способность Т-клеток ЦАР в ответ на антиген.Клетки, которые расширены меньше функционально превосходят те, широко культурных в течение более длительного времени. В человеческой модели ксенотрансплантата мыши ВСЕХ сравнивается потенция Т-клеток CAR, собранных в разные периоды времени. Девятидневные клетки показывают дозозависимый анти-люкемический ответ с полным ответом стоит высокую дозу в три миллиона; и потерю эффективности для низкой дозы 500 000.Тем не менее, в день три клетки показали стойкий контроль опухоли в высоких и низких дозах. Этот ответ связан с абсолютным подсчетом CAR-T 19 в периферической крови мышей. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что ЦАР Т-клеток, собранных ранее, превосходят тех, собранных позже.После этой процедуры, дополнительные анализы функции, такие как анализ морского конька могут быть выполнены для измерения их метаболических свойств, таких как потребление кислорода или spir-it-ed потенциала. Несколько раундов рестимуляции также могут быть выполнены, чтобы дать представление об их дифференциации и стойкости Т-клеток CAR. Используя эту работу в качестве основы, мы и другие исследователи занимаемся исследованиями по дальнейшему сокращению культурного процесса.Он также может быть расширен в основных подходов дизайн для других антигенов рака. Уход всегда должны быть приняты, когда вы работаете с лентивирусом. Но даже тогда, когда лентивирус разработан, чтобы быть репликации некомпетентным.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Исследования рака

Это видео демонстрирует метод производства химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток ex vivo. Т-клетки человека инкубируются с магнитными шариками, покрытыми анти-CD3 и анти-CD28 антителами, а также средой с добавлением интерлейкина-2 (IL-2), что приводит к активации и пролиферации Т-клеток. Вводятся трансгенные лентивирусные векторы, позволяющие трансгенной РНК интегрироваться в геном хозяина и экспрессировать трансген. Это приводит к тому, что трансдуцированные Т-клетки экспрессируют...

Метод ex vivo для получения химерных антигенных рецепторов Т-клеток

Это видео демонстрирует технику генерации ex vivo Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) опухолевого антигена. Ретровирусные векторы, несущие трансгенную РНК, смешивают с клетками селезенки в среде с добавлением интерлейкина-2 для содействия выживанию и пролиферации Т-клеток. Затем смесь переносят на пластину, покрытую рекомбинантными фрагментами фибронектина человека, и центрифугируют, чтобы облегчить слияние вируса с клеткой, что позволяет РНК интегрироваться в геном хозяина и...

Метод ex vivo для получения опухолеспецифичных химерных антигенных рецепторов Т-клеток

Мы описываем количественную систему анализа цитолизва в реальном времени в режиме реального времени для оценки потенции химерных антигенных рецепторов Т-клеток, нацеленных на жидкие и твердые опухолевые клетки. Этот протокол может быть расширен для оценки других клеток иммунного эффектора, а также комбинированных методов лечения.

В режиме реального времени потенции Асса для химерных антигенов рецепторов T клеток ориентации твердых и гематологических раковых клеток

Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.

Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток

В этой статье подробно описан процесс производства Т-клеток с химерным антигенным рецептором для клинического использования, в частности, с использованием автоматизированного клеточного процессора, способного выполнять вирусную трансдукцию и культивирование Т-клеток. Мы даем рекомендации и описываем подводные камни, которые следует учитывать при разработке процесса и проведении ранней фазы клинического исследования.

Производство Т-клеток химерного антигенного рецептора на автоматизированном клеточном процессоре

Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.

Эффективная генерация мышиных химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток

Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для создания и тестирования химических антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs).

Генерация Т-клеток, регуляторных химерных антигенных рецепторов человека

В этом протоколе подробно описана процедура получения транзиторных химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток с использованием неинтегрирующей мРНК для иммунотерапии рака, а также представлены надежные методы оценки CAR-T-клеток и их цитотоксической функции.

Невирусный подход к получению транзиторных химерных антигенных рецепторов Т-клеток с использованием мРНК для иммунотерапии рака

Здесь мы опишем метод создания двойных эмульсионных капель, инкапсулирующих одну Т-клетку и раковую клетку-мишень, для изучения уничтожения клеток на уровне одной клетки. Этот метод позволяет проводить двойное количественное определение как цитотоксических молекул, так и апоптоза клеток-мишеней в большой популяции Т-клеток.

Анализ цитотоксичности на основе капель для оценки химерных антигенных рецепторов Т-клеток на уровне одиночных клеток

Этот протокол описывает основные этапы культивирования первичных Т-клеток, включая их выделение, активацию, расширение и переходную трансфекцию с помощью мРНК-электропорации. Кроме того, предлагается панель рабочего процесса и антител для цитометрического анализа потокового анализа фенотипа, маркеров активации, жизнеспособности и экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR).

Выделение, культивирование и временная трансфекция первичных человеческих Т-клеток для получения Т-клеток химерных антигенных рецепторов (CAR)

Узнайте метод генерации CAR T-клеток с сохранением функциональной компетентности для применения в приёмной иммунотерапии онкологических заболеваний. Этот подход позволяет получить качественные Т-клетки без терминальной дифференцировки.

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Больше видео