Name: Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU) (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: Изучите метод быстрой метаболической маркировки РНК с 4-тиоурацилом в Saccharomyces cerevisiae. Этот протокол обеспечивает высокую специфичность и низкий фон для анализа вновь синтезированной РНК.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана Wellcome финансирования JB (104648). Работа в Wellcome Центр клеточной биологии поддерживается Wellcome основного финансирования (092076). Авторы признают членов лаборатории за их помощь: Белла Модлин, Эмануэла Сани, Сюзанна Де Лукас-Ариас и Shiney Джордж. Авторы также хотели бы поблагодарить Патрика Крамера за плазменных YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Эта статья представляет протокол для чрезвычайно быстрой и конкретной маркировки 4tU, для восстановления зарождающейся, недавно синтезированной РНК от S. cerevisiae после всего лишь 15 с маркировки, с очень низким загрязнением немаркированной РНК.
Пользователь всегда должен заботиться о поддержании целостности РНК с помощью низких температур и DEPC обработанных реагентов. Очистка грядки стрептавидина, как правило, надежна; однако, буфер биса трудн для того чтобы отрегулировать; он должен быть сделан заново, с его компонентами добавлены в правильном порядке, а не охлажденным или автоматически. Общие недостатки включают РНК неполно растворяется после выпадения шагов, и поэтому либо не биотиниляции или иным образом потеряли во время обработки шагов. Существует обширная помощь по устранению неполадок в дополнительном материале.
Есть некоторые ограничения, чтобы быть в курсе в ers4tU. Один из уже упомянутых является то, что 4tU замедляет рост дрожжей(Рисунок 1a). Помимо эндогенно thiolated РНК9, только РНК, которые были транскрибированы в период маркировки могут быть очищены с помощью этого метода. Полимеразы, приостановленные на генах на протяжении всего времени тиолации, не будут производить thiolated транскрипты, которые могут быть очищены, хотя транскрипты, которые частично помечены из-за полимеразы ввода или оставить приостановленное состояние во время тиолации могут быть восстановлены. Штаммы, которые транскрибируют плохо, либо из-за мутации или условия роста, производят мало nsRNA, хотя методы, используемые здесь, тем не менее улучшить восстановление nsRNA по сравнению с другими методами. Более длительные времена и увеличение объема культуры могут быть необходимы в этих штаммов и условий. Обратите внимание, что uracil является хорошим источником азота и поэтому этот метод должен быть опробован перед использованием для исследований, связанных с голодом азота.
Протокол ers4tU особенно полезен для анализа недолговечных РНК, многие из которых настолько быстро деградируют, что их невозможно идентифицировать без нанесения поврачного механизма деградации. Примеры включают загадочные нестабильные стенограммы (CUTs)4, и короткие стенограммы, подготовленные преждевременного прекращения или промоутер проксимальной паузы18 и антисмысл транскрипции "вверх по течению" от промоутера (PROMPTs)19. Промежуточные, производимые при обработке стабильных видов РНК, также преходящи, но могут быть обогащены с помощью транскрипции ers4tU4. Таким образом, протокол ers4tU является исключительным в разрешении высокопреходящих видов РНК, которые будут проанализированы и захвачены в почти физиологических условиях, что является огромным преимуществом по сравнению с другими методами. Этот метод был использован для изучения транскрипции и вниз по течению РНК обработки кинетики в РНК-полимеразы мутантов, которые удлиняют быстрее или медленнее, чем обычно20.
Тиоляция также совместима с РНК-сек и SLAM-seq21, что позволяет все РНК производится в течение очень короткого времени, чтобы быть охарактеризованы в изысканных деталей.

РНК имеет динамический характер; вскоре после того, как он производится много РНК быстро обрабатывается и деградирует. В настоящее время большинство исследований метаболизма РНК анализируют общую клеточную РНК, которая в основном полностью обрабатывается и находится на стабильном уровне. Этот уровень зависит от баланса между темпами транскрипции, посттранскрипционным созреванием и деградацией. Анализ процессов, ведущих к устойчивому равновесию состояния, требует специализированных методов для захвата очень недолговечных видов РНК.
Метаболическая маркировка РНК нуклеотидными аналогами, такими как 4-тиурацил (4tU) или 4-тиуридин (4sU) (см. Duffy et al.1 для отличного обзора), дает возможность изолировать тио-маркированные зарождающиеся РНК и их промежуточные обработки. Тем не менее, опубликованные протоколы включают маркировки раз в несколько минут2,3, что медленно по отношению к скорости производства многих стенограмм. Это занимает порядка одной минуты, чтобы расшифровать средний ген дрожжей, так маркировки дрожжей РНК менее чем за одну минуту можно считать чрезвычайно коротким. Чрезвычайно быстрый и конкретный 4 thiouracil протокол (ers4tU) максимизирует сигнал к шуму соотношение путем максимизации 4tU включения и минимизации восстановления немаркированной, уже существующие РНК делает очень короткие времена маркировки возможно4.
Тио-модифицированная база должна быть импортирована в клетки быстро и в достаточном количестве, чтобы эффективно маркировать недавно синтезированную РНК (nsRNA). Для содействия этому, клетки выращиваются в uracil-свободной среде, и выражение соответствующего permease помогает повысить поглощение 4tU или 4sU (см. Таблица 1 для списка плазмидов, которые несут подходящие пермяки генов и дополнительная цифра1). Растворимость гидроксида натрия 4tU позволяет избежать необходимости в токсичных органических растворителях, необходимых для других нуклеотидных аналогов. К сожалению, растущие культуры в течение длительных периодов с тио-модифицированными нуклеозидов в концентрациях более 50 мкм наблюдается нарушить рибосомы5. Тем не менее, концентрация (10 мкм), используемых здесь, и чрезвычайно короткое время маркировки, свести к минимуму вредные эффекты5 (Рисунок1а),в то же время принося достаточно РНК для анализа.
Этот метод можно комбинировать с быстрым и специфическим auxin-опосредованным истощением протеина цели6,7 (Рисунок2),refer to как «протокол AID 4U, в котором й-эстрадиол отрегулированное выражение auxin индуцируемая система дегрена (AID) сочетается с маркировкой 4tU. При подходе к AID 4U, целевой белок может быть истощен и влияние на метаболизм РНК тщательно контролируется(рисунок 2). Время имеет решающее значение; целесообразно просмотреть сопроводительное видео и обратить пристальное внимание на рисунок 2 и его анимированную форму (см. Дополнительную рисунок 2).
Обработка и деградация РНК должны быть остановлены чрезвычайно быстро для точного разрешения времени. Это достигается с помощью метанола при низкой температуре, который фиксирует содержимое клеток очень быстро и ухудшает клеточной мембраны при сохранении содержания нуклеиновой кислоты8. Извлечение РНК должно быть эффективным и не повредить РНК. Механический лизис эффективен при отсутствии хотропных агентов (часто они содержат тио группы, поэтому следует избегать). Предпочтительным является осадки в хлориде лития РНК, так как тРНК менее эффективно осаждаются. tRNAs быстро транскрибируются и, естественно, thiolated9, так что удаление tRNAs снижает конкуренцию за биотиниляции реагента. Если небольшие, высоко структурированные РНК представляют интерес, рекомендуется использовать методы выпадения РНК на основе спирта.
Для восстановления thiolated РНК, биотин ковалентно прилагается через тио групп, включенных в РНК с 4tU. Использование модифицированного биотина, который крепится через расщепленную дисульфидную связь (например, HPDP-биотин (N-6-(Biotinamido)hexyl-3 --(2 --pyridyldithio)propionamide, ) или MTS-biotin (Метанет тиосульфонат)) как это позволяет высвобождение РНК путем добавления редукта. Биотинилатированная РНК сродство очищается от стрептавидина в сочетании с магнитными бусинами. Этот протокол аналогичен другим перечисленным ранее10, но был интенсивно оптимизирован для уменьшения фона.
Есть два типа тиол маркировки эксперимент, который может быть выполнена, непрерывная и прерывистая маркировка. Каждый из них имеет свои преимущества. При непрерывной маркировке 4tU добавляется к культуре и образцам, взятым через регулярные промежутки времени. Этот тип эксперимента показывает, как рнк обрабатывается и как уровни меняются с течением времени. Примеры включают сравнение мутантов с экспериментами дикого типа и эксперимент омпульс-погони. Эксперименты, показанные на рисунке 3b,c, относятся к этому типу. Для прерывистой маркировки изменение индуцируется в систему и РНК контролируется. После того, как изменение было вызвано культуры должны быть разделены на несколько субкультур, и в определенное время, каждый из них затем thio-маркировки в течение короткого периода. Одним из примеров является q-est AID 4U показано на рисунке 27. Этот тип эксперимента особенно полезен для мониторинга влияния метаболических изменений на обработку РНК (см. рисунок 3d).
Графическое представление эксперимента по маркировке thio представлено на рисунке 4 и рисунке 5, а электронная таблица, которая значительно упрощает производительность протокола, доступна (см. шаблон эксперимента 4tU.xlsx). Помимо этого дополнительная информация содержит обширное руководство по устранению неполадок. Для протокола q-est AID 4U, который интегрирует маркировку 4tU с протоколом истощения auxin, см. Рисунок 2 и Дополнительная диаграмма 2. Смотрите Barrass et al.7 для подробного протокола об истощении AID.

<table><tbody><tr><td>&beta;-меркаптоэтанол (&beta; ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ОСТОРОЖНО токсичен. Исходные растворы примерно 14 М, сделать в 1/20 разбавить для использования</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>ОСТОРОЖНО токсичный</td></tr><tr><td>диэтилпирокарбонат (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>добавить 1/1000 объема в раствор, оставить при комнатной температуре на 24 часа, затем автоклав</td></tr><tr><td>DMF (N,N-диметилформамид)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>ОСТОРОЖНО токсичный</td></tr><tr><td>ЭДТА</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Make 0,5 M и pH до 8,0 с гидроксидом натрия</td></tr><tr><td>Этанол</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotin</td><td>Thermo scientific</td><td>21341</td><td>Хранить в защищенном от света месте. Растворите все содержимое флакона в 22,7 мл ДМФА (для получения исходного раствора 4 мМ). Хранить вдали от воды, в темноте и при -20 °С. Проверьте раствор перед использованием, так как некоторые партии HPDP выпадают в осадок при хранении; Нагрев до 42°С; C для повторного использования.</td></tr><tr><td>Глюкоза</td><td>Фишер Научный&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>Гликоген [20 мг/мл]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>хранить при -20 °°; C</td></tr><tr><td>Иммобилизованный гель для восстановления дисульфида TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>Опционально</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 М раствор. ВНИМАНИЕ: он становится очень горячим, так как растворяется и даже может кипеть при температуре более 100 oC, медленно добавляйте кристаллы LiCl в воду.</td></tr><tr><td>Магния хлорид (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 М раствор. ВНИМАНИЕ: он становится очень горячим, так как растворяется и даже может кипеть при более чем 100 oC, добавьте кристаллы MgCl2 в воду медленно.</td></tr><tr><td>Метанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>ОСТОРОЖНО Токсичный и легковоспламеняющийся</td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Сделайте по 1 М раствору каждого и смешайте в равных количествах для получения раствора соответствующего pH</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 М раствор</td></tr><tr><td>фенола, низкий уровень pH. &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Хранить в темноте при температуре 4 °C. ОСТОРОЖНО токсичный</td></tr><tr><td>фенолхлороформ 5:1 (125:24:1) с низким pH.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>Хранить в темноте при температуре 4 °C. ОСТОРОЖНО токсичные</td></tr><tr><td>спин-колонны Pierce Thermo</td><td>Scientific</td><td>69702</td><td>Опционально</td></tr><tr><td>SCSM одинарный дропа &ndash; ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>Ацетат натрия</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>Приготовьте 3 М раствор и pH до 5,3 с уксусной кислотой</td></tr><tr><td>Гидроксид натрия</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>ОСТОРОЖНО коррозионные</td></tr><tr><td>SDS (додецилсульфат натрия)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>ОСТОРОЖНО раздражающее средство, не вдыхать</td></tr><tr><td>стрептавидин Магнитные шарики</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>Хранить при температуре 4&�С; С&nbsp;</td></tr><tr><td>СУПЕРаза-Ин, ингибитор РНКазы</td><td>Технологии жизни&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>Магазин при -20° C</td></tr><tr><td>Тиолированный Schizosaccharomyces pombe для спайка</td><td></td><td></td><td>См. раздел 1.7 протокола</td></tr><tr><td>4-тиоурацил (4tU)&nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>Хранить в темное время суток. Сделать 100 мМ Сток в 1М NaOH, хранить решения при -20°С.</td></tr><tr><td>Трис основание</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1 М растворы при различных рН</td></tr><tr><td>тРНК</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5мг/мл, хранить при -20°С; </td></tr><tr><td>C Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Сделать 1 М раствор в H2O. Разделить на 2 мл аликвот и хранить при -20 С.</td></tr><tr><td>Дрожжевая азотная основа без аминокислот&nbsp; с сульфатом аммония</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Columns 0,5мл</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>Store at 4 &deg; С&nbsp;</td></tr><tr><td>Диоксид циркония</td><td>Чертополох Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Оборудование и расходные материалы</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>Можно использовать и другие гомогенизаторы, при этом должны быть установлены правильные условия для каждого гомогенизатора и штамма.</td></tr><tr><td>Биоанализатор (Agilent) или аналогичный для оценки качества РНК. Если это не важно, для количественного определения РНК полезен спектрофотометр.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Центрифуга: способна вращать культуры при 4°°; С и не менее 3000 г. По возможности предварительно охладите.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Центрифуга: способна вращать пробирки объемом до 2 мл с переменной скоростью до 13 000 г и до 1000 г&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Магнитный штатив для отделения бусин от образца. Тот, который используется в бумаге, напечатан на 3D-принтере, его можно приобрести в Thingiverse (thing:3562952). Существуют коммерчески доступные стойки&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ПЦР-аппарат с подогреваемой крышкой, что позволит проводить инкубацию в темное время суток.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Вращающееся колесо для вращения трубок объемом 1,5 мл из конца в конец&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Рекомендуется встряхивать нагревательный блок (например, термомиксер Eppendorf)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Пробирки, центрифуга, Низкое удержание, без РНКазы 0,5 мл</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Пробирки, центрифуга, Низкое удержание, без РНКазы 1,5 мл</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>Пробирки, центрифуга, 50 мл&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Другие центрифужные пробирки не являются газонепроницаемыми, что позволяет CO2 растворяться в метаноле, это выходит из раствора энергично при добавлении теплой культуры, что приводит к потере</td></tr><tr><td>пробы. Пробирки, центрифуга, 15 мл&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Пробирки, 2 мл, завинчивающаяся крышка</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>Пробирки 0,2 мл полоска 8 шт. со встроенными крышками</td><td>Бренд</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in vivo с 4-thiouracil (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Нуклеотида аналог, 4-тиурацил (4tU), легко берется клетками и включены в РНК, как это транскрибируется in vivo, что позволяет изоляции РНК производится в течение короткого периода маркировки. Это делается путем присоединения биотин moiety к включены тио группы и сродство очистки, с использованием стрептавидин покрытием бисера. Достижение хорошей урожайности чистой, недавно синтезированной РНК, которая свободна от уже существующей РНК, делает возможным более короткое время маркировки и позволяет увеличить временное разрешение в кинетической исследованиях. Это протокол для очень специфической, высокой очистки от синтезированной РНК. В представленном здесь протоколе описывается, как РНК извлекается из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Однако протокол по очищению тиолированной РНК от общей РНК должен быть эффективным с использованием РНК из любого организма после того, как она была извлечена из клеток. Очищенная РНК подходит для анализа многими широко используемыми методами, такими как обратная транскриптаза-qPCR, РНК-сек и SLAM-seq. Специфика, чувствительность и гибкость этого метода позволяют получить беспрецедентное понимание метаболизма РНК.

Использование thiolated uracil чувствительно и специально очистить недавно транскрибированной РНК от дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Этот метод имеет важное значение, поскольку ни один другой протокол не позволяет анализировать недавно синтезированную РНК в такой короткой шкале времени и позволяет проводить эксперименты с пульсом с таким коротким пульсом. Этот протокол хорошо работает с истощением белка, например, с протоколом Best AID 4U. Основным преимуществом является то, что фон низкий.Это позволяет короткое время маркировки, удалив почти все нетизолированную РНК. В письменном протоколе также подробно много различных типов экспериментов, которые могут быть выполнены и как интегрировать их в этот метод. Чтобы начать эту процедуру, выращивать дрожжи в среде YMM до OD 600 между 0,6 и 0,8.В дымовой капот добавьте метанол, эквивалентный 30-50% от предполагаемого объема образца, в 50 миллилитровую трубку. Закройте трубки плотно, этикетки их, и поместите их на сухой лед, чтобы охладить. Далее наклеить две миллилитровые трубки для длительного хранения образцов и поместить на лед для охлаждения.Добавьте бисер цирконии в две миллилитровые трубки. Охладить по крайней мере один миллилитр воды на образец на льду. Если к культуре добавляется шип S.pombe, поместите алициты изолированных клеток S.pombe на лед, чтобы оттаять.Vortex оттаял aliquot и добавить его в культуру. Затем добавьте 4tU в культуру к концентрации 10 микромоляров и тщательно перемешайте. Thio-лейбл в течение времени от 15 секунд до пяти минут.Возьмите образцы культуры через регулярные промежутки времени до конца курса времени. Добавьте каждый образец в одну из подготовленных центрифугных трубок, содержащих метанол. Запечатать каждую трубку, встряхнуть, тщательно перемешать, и поместить на сухой лед.После того, как все образцы были сделаны, поместите их все на лед. Убедитесь, что ни один из образцов не замерз. Если таковые имеются заморожены, тепло их мягко в руке, инвертирование постоянно.Центрифуга клетки на 3000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут, чтобы гранулировать клетки. Слейте жидкость, и повторно гранулы, по крайней мере один миллилитр ледяной воды энергично трубопроводов вверх и вниз. Перенесите подвеску на подготовленную крышку винта и поместите трубку на лед.Центрифуга образцов кратко на скорости более 13000 раз г, чтобы повторно гранулировать клетки. Затем поместите их обратно на лед, и удалить жидкость. Во-первых, добавьте в 400 микролитров буфера АЕ, 40 микролитров SDS и 800 микролитров фенола при низком рН.Resuspend вихрем в течение 10 секунд. Затем высасывай клетки в гомогенизаторе в течение трех двух минут очередей при наименьшей мощности настройки. Оставьте образцы на льду на две минуты между импульсами гомогенизации.Поместите обливные клетки на сухой лед в течение пяти минут, пока он не затвердеет. Затем используйте микроцентрифуг, чтобы вращать клетки со скоростью более 13 000 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого выполните извлечения фенола хлороформа и извлечения хлороформа, как указано в текстовом протоколе.Добавить от 1/3 до 1/2 объема 10 молярного хлорида лития и перемешать, чтобы вызвать РНК. Центрифуга на скорости более 13 000 раз г в течение пяти минут. Удалите жидкость, и кратко повторно спина образца, чтобы удалить отбросы.Затем промыть гранулы с 300 до 500 микролитров 70% этанола. Центрифуга промыть гранулы кратко, и удалить все оставшиеся этанола. Повторно растворить гранулы РНК в 90 микролитров TE при рН 7.0 путем нагрева при 65 градусах по Цельсию во время встряхивания.После проверки на полную РНК solubilization, передать подвеску на 0,2 миллилитров трубки. Для начала, биотинилат, добавив 10 микролитров раствора HPDP-биотина в РНК и тщательно перемешать. Инкубировать в темноте при 65 градусах по Цельсию в течение 15 до 30 минут.Далее подготовь небольшой объем смолы, столбец исключения размера, чтобы исключить неинкорпорированный биотин. Снимите нижнюю метку колонны, ослабьте крышку и поместите колонну в двухми миллилитровую центрифугу. Центрифуга в 1500 раз г в течение одной минуты, чтобы смыть буфер и отбросить поток через.Затем аккуратно добавьте 0,3 миллилитров TE в верхнюю часть колонны и снова вращайте, используя те же условия. Перенесите промытую колонку в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Когда инкубация образца будет завершена, добавьте образец в верхнюю часть столбца.Центрифуга в 1500 раз г в течение двух минут, оставляя биотинилированный образец РНК на дне трубки. Отбросьте столбец. И добавить от 1/3 до 1/2 тома 10 молярного хлорида лития в трубку, содержащую образец.Смешайте, чтобы повторно ускорить РНК. Во-первых, повторно растворить РНК в 200 микролитров DEPC-обработанной воды. Измерьте концентрацию РНК и рассчитайте объемы для каждого образца, который даст одинаковое количество РНК для всех образцов.Добавьте это количество РНК в свежую трубку и добавьте воду, обработанную DEPC, до общего объема в 200 микролитров. Когда образец находится при комнатной температуре, добавьте 25 микролитров буфера 10 x NaTM, 25 микролитров одного молярного фосфата натрия и 2,5 микролитера 10%SDS. Тщательно перемешать и центрифугу аккуратно примерно 100 раз г менее чем за 30 секунд.Подготовь два миллилитров буфера бисера для каждого образца с буфером х NaTM, 0,1 молярного фосфата натрия и 0,1% SDS. Добавьте 50 микролитров стрептавидиновых бусин к низкой удержанию 1,5 миллилитровой трубки. Поместите трубку на магнитную стойку и ждать, пока бисер урегулировать.Затем удалите жидкость путем аспирации. Чтобы вымыть бисер, добавьте 200 миллилитров буфера бисера и вихря до тех пор, пока гранулы шарика полностью не будут перерасходоваться. Центрифуга трубки примерно в 100 раз г в течение максимум пяти секунд.Поместите трубку в магнитную стойку, чтобы шарики были захвачены магнитом. Удалите жидкость путем аспирации, если есть небольшое количество образцов. Слейте жидкость, а затем аспирировать, если Есть много образцов.Блок с 200 микролитров буфера бисера, 10 микролитров гликогена и 2,5 микролитров тРНК. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут при вращающемся конце над концом на умеренной скорости. После этого снимите жидкость и снова вымойте, как указано в текстовом протоколе.Переподход бисера в образце, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут во время вращения. Во время этой инкубации приготовьте свежую 1,5 миллилитровую трубку для каждого образца. Добавьте 1/10 тома трех ацетата молярного натрия при рН 5,3 и 20 микрограммах гликогена.Центрифуга примерно 100 раз г в течение трех секунд. Снимите неохваченную РНК с бисера и вымойте их, как указано в текстовом протоколе. Чтобы утоить РНК, добавьте в бисер 50 микролитров свежеприготовленного 0,7 молярного бета меркаптоэтанола.После вихря и центрифуги поместите суспензию в магнитную стойку. Pipette РНК, содержащий раствор в подготовленных 1,5 миллилитров центрифуги труб. Elute еще раз, как описано ранее.Затем поместите образец обратно в магнитную стойку, чтобы удалить остаточные бусы из элайта РНК и передать жидкость в свежей, низкой привязки 0,5 миллилитра центрифуги трубки. Смешайте образец. А затем добавить 2,5 тома этанола для осаждения nsRNA.После смешивания и инкубации центрифуга со скоростью не менее 13 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Типичные урожаи для snRNA восстановлены с помощью этого протокола показаны здесь. Обратите внимание, что восстановление РНК в нулевой точке времени является очень небольшой частью, что восстановлено из более длительных точек времени только 0,3 микрограмма РНК восстанавливается примерно из 30 миллиардов клеток.После всего лишь 30 секунд маркировки, однако, более чем в два раза больше РНК собирается из того же количества клеток. В следе биоанализа наши прекурсоры РНК можно рассматривать как пик около 1000 нуклеотидов и дублет пиков в 1 700-1800 нуклеотидов. Обилие этих промежуточных увеличивается по мере того, как продолжается тиолирование.Затем проводится тиолирование с пробами, взятыми с интервалом в 15 секунд с начала тио-маркировки, и контролируется обработка транскрипта РНК ACT1. Как видно до мРНК и лариаты генерируются даже после всего лишь 15 секунд маркировки. Примерно через 45 секунд до одной минуты, количество лариатов и предварительной мРНК достичь равновесия с таким же количеством этих видов РНК создаются транскрипции, как обрабатываются прочь путем сращивания.Наиболее сложные шаги, связанные с бисером, стирка, и блокирование. Будьте осторожны, чтобы не потерять бисер, или дать им высохнуть. После очистки недавно синтезированной РНК можно использовать любую традиционную процедуру анализа РНК.Рекомендуется запустить РНК на биоанализе или аналогичный. После этого мы обычно используем ККПЧ и РНК-Сек для анализа РНК. Этот метод оказался идеальным для анализа кинетики обработки РНК.Наиболее опасными шагами являются те, которые используют фенол и хлороформ в экстракции РНК. Каждый раз, когда вы используете эти химические вещества в незапечатанные контейнера, сделать это в дым капот, и носить соответствующую защитную одежду, лабораторное пальто, и перчатки. Позаботьтесь о том, чтобы в нитью винтовой трубки не было бисера цирконии, так как это приведет к утечке.

extremely-rapid-specific-metabolic-labelling-rna-vivo-with-4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

РНК-транскрипты подвергаются обширные посттранскрипционные регулирование, которое опосредуется множеством транс действия РНК-связывающими белками (ОДП). Здесь мы представляем обобщению метода точно определить и на транскриптома масштабе РНК места связывания ОДП.

PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

Всего клеточной РНК обеспечивает плохое шаблон для изучения краткосрочных изменений в синтез РНК и распада, а также кинетики процессинга РНК. Здесь мы описываем метаболический маркировки вновь транскрипции РНК с 4-тиоуридина последующим тиол-специфический биотинилирования и очистки вновь транскрипции РНК позволяющих преодолеть эти недостатки.

Метаболический маркировки Недавно Transcribed РНК за большой размер профилирования экспрессии генов синтеза РНК, производство и разложение в культуре клеток

Этот протокол описывает комбинаторного использования чип seq, 4СУ seq, Общая РНК seq и рибосома профилирование для клеточных линий и главные ячейки. Это позволяет отслеживание изменений в фактор транскрипции привязки, de novo транскрипции, обработки РНК, оборот и перевод с течением времени и отображает общий ход событий в активированных или быстро меняющейся клеток.

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Мы описываем оригинальной платформе анализ передачи РНК, именем пятно (обтекаемый платформа для наблюдения тРНК). Пятно одновременно измеряет клеточном уровнях всех tRNAs в биологических образцах, только три этапа в менее чем 24 часа.

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Этот метод может использоваться для измерения синтез РНК. 5-Bromouridine добавляется к клеткам и включены в синтезированных РНК. Синтез РНК измеряется РНК добыча сразу после маркировки, следуют 5-Bromouridine ориентированные иммунопреципитации помечены РНК и анализ обратной транскрипции и количественных полимеразной цепной реакции.

Исследования синтеза РНК с помощью 5-Bromouridine маркировки и иммунопреципитации

Протокол, описанные здесь основан на количественное определение генома общесистемной вновь синтезированной мРНК, очищенного от дрожжевых клеток с 4-thiouracil. Этот метод позволяет измерять синтез мРНК, расцеплено от гниения мРНК и, таким образом, обеспечивает точное измерение II транскрипции РНК-полимеразы.

Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности

В данной статье описывается двухцветное мечение длинных РНК в конечных положениях и их поверхностная иммобилизация путем инкапсуляции в фосфолипидные везикулы для применения в одномолекулярной микроскопии FRET TIRF. Сочетание этих методов позволяет точно визуализировать и анализировать динамику РНК на уровне отдельных молекул.

Флуоресцентное мечение концов и инкапсуляция длинных РНК для одномолекулярной микроскопии FRET-TIRF

Этот протокол описывает быструю и высокочувствительную квантификацию Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) данных датчиков с использованием заказных портативного анализатора ладу. Устройство было использовано для обнаружения мальтозу в пределах диапазона критических температур, что обеспечивает максимальную чувствительность обнаружения, что позволяет практическую и эффективную оценку содержания сахара.

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Адсорбция пептидов на пластиковой посуде во время традиционных серийных разведений на основе наконечников может значительно повлиять на определение потенции и затруднить понимание взаимосвязей между структурой и активностью, используемое для идентификации свинца и оптимизации свинца на этапах разработки лекарств. Здесь описаны методы автоматизированного акустического бесконтактного серийного разведения образцов пептидов.

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

Мы описываем протокол для определения RNA-связывая протеинов и сопоставления их RNA-связывая регионов в живых клеток с помощью УФ опосредованной photocrosslinking и масс-спектрометрии.

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Изучите метод быстрой метаболической маркировки РНК с 4-тиоурацилом в Saccharomyces cerevisiae. Этот протокол обеспечивает высокую специфичность и низкий фон для анализа вновь синтезированной РНК.

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

Больше видео