Выявление мутаций путем таяния высокого разрешения в TILLING населения риса
2 сентября 2019 г.
В этой статье мы представляем протокол, который описывается как анализ плавления с высоким разрешением (HRM) на основе целевых индуцированных локальных поражений в геномах (TILLING). Этот метод использует изменения флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК и подходит для высокой пропускной связи скрининга как вставки / удаления (Indel) и одной базы субстанции (SBS).
Было бы весьма полезно для размножения черты, которые технически трудно или дорого, чтобы быть определены, такие как устойчивость к болезням, содержание минералов. Это довольно простая, экономия и высокая пропускная способность. Для начала поместите четыре листа дисков в каждый колодец 96-хорошо ПЦР пластины.
Добавьте в каждую колодец 50 миллилитров буферного раствора А. Заморозить тарелку в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем разморозить пластину при комнатной температуре.
Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Добавьте 50 микролитров буфера B к каждой хорошо, и хорошо перемешать вихрем. Центрифуга пластины в течение одной минуты при 1500 раз г.
Соберите супернатант в качестве ДНК для ПЦР. Во-первых, используйте супернатант ДНК от одного хорошо, как шаблон ПЦР для оптимизации температуры annealing. Добавьте реагенты и один микролитр супернатанта ДНК в каждый ПЦР хорошо.
Поместите трубы ПЦР в тепловой блок, способный градиента, и отрегулируйте программу нагрева в соответствии с рукописью, чтобы определить оптимальную температуру для каждого фрагмента цели. Выполните электрофорез для продукта ПЦР на 1%agarose гели для изучения ампликонов. Определите оптимальную температуру анеаля, которая позволяет конкретное усиление фрагмента цели.
Для проведения анализа HRM объедините реагенты, включая один микролитер 10-х раз флуоресцентного красителя и один микролитер супернатанта ДНК в каждом колодец HRM-совместимых пластин. В каждой пластине, включают один дикий тип родительского образца и один отрицательный контроль без ДНК. Добавьте каплю минерального масла в каждую колодец, чтобы предотвратить испарение.
Затем загерметив пластину клейкой пленкой и центрифугой по 1000 раз г в течение одной минуты. Запустите ПЦР с использованием оптимизированной температуры аннеаля. Теперь снимите клейкую пленку с пластины и вставьте пластину в машину HRM.
В программном обеспечении выберите New Run из меню файла или нажмите кнопку Run в верхней части экрана. Укажите начальную и окончание температуры расплава от 55 до 95 градусов по Цельсию. Выберите образцы для анализа плавления с высоким разрешением и исключите образцы, аналогичные отрицательному контролю.
Нормализация кривых плавления, чтобы иметь то же начало и окончание флуоресценции. Визуально подтвердите, что курсоры более низкой минимальной и низкой максимальной температуры находятся в области кривых. Держите дельту F, разницу флуоресценции, уровень по умолчанию настройки 05.
Из списка выбора Стандартов выберите общий по сравнению с вариантом и выберите нормальную чувствительность. Выберите H12 для использования дикого типа в качестве элементов управления. Образцы с значением дельты F, более 05, считаются содержат мутантное растение.
Затем, используя метод CTAB, извлечь ДНК из каждого из четырех растений из мутантного бассейна с кривой плавления значительно отличается от дикого типа. После количественной оценки с помощью спектрофотометра, отрегулируйте ДНК с NanoDrop 2000 до окончательной концентрации примерно 25 нанограмм на микролитр. Добавьте 0,4 микролитров праймеров ПЦР в образец ДНК в трубах ПЦР, поместите их в тепловой циклер и отрегулируйте программу для усиления фрагмента цели.
Затем отправьте продукты PCR компании для секвенирования. После секвенирования Sanger сравните молекулярное поражение, сравнив последовательности между растением M2 и диким типом. В этом исследовании, HRM сканирования и анализа саженцев M2 для мутаций в OsLCT1 или SPDT генов показали, что большинство образцов были плавления кривых не значительно отличается от дикого типа с дельтой F менее 05.
Мутанты показали значительно разные кривые HRM с дельтой Fs больше 05 при температуре от 90 до 92 градусов по Цельсию и от 81,5 до 83,5 градусов по Цельсию, соответственно. Тип мутации и положение на генах из 4 560 M2 саженцев были подтверждены секвенированием хроматограмм. Выявлен гетерозиготный участок с мутацией от G до A на 4, 304 базовых парах OsLCT1.
Одна вставка нуклеотида А появилась на 4, 240 базовых парах OsLCT1, а удаление тринуклеотида TTC наблюдалось в положении 5, 948 до 5, 950 базовых пар SPDT. Я оптимизирую ПЦР до анализа HRM. Краситель в гель немного вредно.
Не забудьте надеть перчатки при запуске геля.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол метода Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM). Этот метод эффективен для высокопроизводительного скрининга мутаций типа инсерция/делеция (Indel) и однонуклеотидных замен (SBS).
Основные компоненты исследования
Область науки
- Геномика
- Селекция растений
- Молекулярная биология
Теоретические основы
- Анализ плавления с высоким разрешением — это метод, используемый для обнаружения генетических вариаций.
- TILLING позволяет выявлять мутации экономически эффективным способом.
- Этот метод особенно полезен для признаков, которые трудно оценить.
- Он может быть применен в различных областях, включая сельское хозяйство и генетику.
Цель исследования
- Предоставить протокол использования HRM-анализа в TILLING.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного скрининга генетических вариаций.
- Повысить эффективность идентификации мутаций, связанных с важными признаками.
Используемые методы
- Подготовка дисков из листьев в 96-луночном ПЦР-планшете.
- Добавление раствора буфера A в каждую лунку.
- Замораживание и размораживание ПЦР-планшета для подготовки образцов.
- Мониторинг изменений флуоресценции в процессе плавления ДНК.
Основные результаты
- Протокол обеспечивает эффективное обнаружение инделей (Indels) и однонуклеотидных замен (SBS).
- Высокая пропускная способность повышает эффективность скрининга.
- Экономичный метод, подходящий для различных областей исследований.
- Облегчает селекцию таких признаков, как устойчивость к заболеваниям.
Выводы
- TILLING на основе HRM является ценным инструментом в генетических исследованиях.
- Данный метод упрощает процесс идентификации мутаций.
- Он может существенно помочь в выведении улучшенных сортов растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
TILLING на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM) позволяет проводить высокопроизводительный и экономически эффективный поиск как однонуклеотидных замен, так и инсерционно-делеционных мутаций в геномах растений. Этот подход способствует валидации мишеней на ранних этапах, предоставляя количественные данные скрининга мутаций, которые служат основой для принятия селекционных решений по таким сложным признакам, как устойчивость к заболеваниям и содержание питательных веществ. Его интеграция с простым методом экстракции ДНК повышает эффективность рабочего процесса в конвейерах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем обнаружения индуцированных мутаций в целевых генах, таких как OsLCT1 и SPDT.
- Практическая ценность: использование HRM-анализа после ПЦР без дополнительной обработки сокращает время ручной работы и увеличивает пропускную способность.
- Прогностическая ценность: значения Delta F выше 0.5 позволяют идентифицировать мутантные образцы, что обеспечивает уверенный отбор хитов для последующей валидации.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Плашки, совместимые с HRM, с наслоением минерального масла предотвращают испарение и обеспечивают воспроизводимое получение кривых плавления.
- Количественные результаты: Нормированные кривые плавления и измерения delta F позволяют объективно сравнивать образцы дикого типа и варианты.
- Масштабируемость: Формат 96-луночной плашки позволяет проводить скрининг тысяч проростков M2, что было продемонстрировано на 4 560 образцах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Подтвержденные с помощью секвенирования по Сэнгеру мутации предоставляют данные о молекулярных повреждениях, которые связывают генотип с фенотипом в программах селекции.
- Сопоставление биомаркеров: Идентифицированные SNP и индели служат детектируемыми маркерами для анализа ассоциации признаков при улучшении сельскохозяйственных культур.
- Снижение рисков: Раннее обнаружение мутаций снижает неопределенность в наследовании признаков перед проведением полевых испытаний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод HRM-TILLING вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проводить скрининг мутаций после мутагенеза и до фенотипической валидации, что способствует идентификации перспективных линий в сельскохозяйственной биотехнологии.
- Открытия в биологии: Облегчает проверку гипотез путем идентификации аллельных вариантов в целевых генах с помощью высокочувствительного анализа кривых плавления.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты HRM, что позволяет стандартизировать обнаружение мутаций в больших популяциях.
- Аналитика: Порог Delta F (>0.5) служит статистической основой для дифференциации мутантных образцов от образцов дикого типа.
- Трансляционные исследования: Мутации, подтвержденные секвенированием, позволяют проводить картирование генотип-фенотип для принятия решений по селекции признаков.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Протокол может быть адаптирован для различных целевых генов и видов сельскохозяйственных культур, помимо риса, что способствует повторному использованию платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает высокочувствительное обнаружение как SNP, так и инделей, сокращая количество ложноотрицательных результатов при скрининге мутаций.
- Практическая ценность: простой, безопасный и быстрый (SSF) метод экстракции ДНК в сочетании с HRM минимизирует расход реагентов и потребность в оборудовании.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении работы в селекционных программах за счет оперативной идентификации полезных аллельных вариантов.
- Влияние на портфель: повышает уверенность при отборе линий с подтвержденными мутациями, снижая риск неудач на поздних этапах.
Особенности реализации
- Требуется навык настройки прибора для HRM-анализа и нормализации кривых плавления.
- Необходим доступ к градиентным амплификаторам для оптимизации температуры отжига.
- Требуются совместимые с HRM планшеты и флуоресцентные красители для точного анализа плавления.
- Требуется возможность проведения секвенирования для подтверждения мутаций, выявленных методом HRM.
- Эффективность может варьироваться в зависимости от длины ампликона и содержания GC-пар, что требует оптимизации для конкретной мишени.
