Извлечение кортизола из осетровых плавников и челюстных матрис

Наш метод вводит новый альтернативный индикатор стресса, который может быть платформой для многочисленных будущих исследований для измерения кортизола в новых не участок и матрицы волос. Преимуществами этого метода являются его простота и способность использоваться для оценки уровня стресса даже у забитых животных. Установление взаимосвязи между высоким уровнем кортизола и здоровых животных или людей, использующих этот метод может помочь с диагностикой некоторых заболеваний.

Этот метод также может быть использован для изучения вековых биологических образцов, таких как эти старые окаменелости для оценки уровня стресса в пределах продолжительности жизни образца. Для извлечения кортизола, вес 300 плюс или минус 10 миллиграммов каждого образца на цифровой аналитической шкале с точностью 0,0001 перед размещением образцов в отдельных 15 миллилитров конических труб. Добавьте три миллилитров изопропанола в каждую пробную трубку и поверните трубки при 80 вращениях в минуту в течение 2,5 минут, чтобы вымыть кортизол и удалить любое потенциальное внешнее загрязнение.

После последней стирки воздух высушит образцы при комнатной температуре в течение семи дней перед стиркой образцов еще три раза, как это было продемонстрировано с использованием свежей ультра чистой воды для каждой стирки. Взвесите 75 плюс-минус пять миллиграммов высушенного образца плавника или челюстной кости и используйте бияду бисера, чтобы, наконец, измельчить образец на 50 герц в течение 32 минут. Затем доставить 1,5 миллилитров метанола в каждую трубку порошкообразного плавника или челюстной кости и поместить образцы на трубчатый ротатор при 40 вращениях в минуту в течение 18 часов при комнатной температуре.

После извлечения кортизола, осадок образцов тканей центрифугации. И перенесите верхний миллилитр желтоватого органического кортизола, содержащего слой из каждого образца, в отдельные микро-центрифугированные трубки на 1,5 миллилитра. Высушите образцы кортизола при 38 градусах по Цельсию в дымовом капюшоне на ночь, чтобы испарить метанол.

На следующее утро добавьте 400 микролитров PBS к каждой трубке и вихрю и центрифуге образцы для сбора кортизола. Для анализа ELISA загрузите 25 микролитров каждого извлеченного стандартного образца кортизола и контролируйте дубликат в соответствующие скважины пластины ELISA на 96 скважинах. Загрузите 25 микролитров разбомбителя Assay на две скважины, чтобы служить нулем и в каждую неспецифическую обязательную скважину.

Смешайте 15 микролитров ферментных конъюгированных с 24 миллилитров разбягощения Assay и добавьте 200 микролитров конъюгации к каждой хорошо. Смешайте пластину на ротаторе в течение пяти минут при 500 вращениях в минуту. Затем один час инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации, мыть пластину четыре раза с 300 микролитров 1x Wash Buffer на колодец. Быстро инвертирование пластины над раковиной после каждой стирки, чтобы отбросить буфер и blotting пластины на стопку бумажных полотенец. После последней стирки добавьте 200 микролитров субстратного раствора TMB к каждой хорошо и поместите пластину на ротатор в течение пяти минут при 500 вращениях в минуту.

После смешивания, инкубировать пластину в течение 25 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации добавьте 50 микролитров стоп-раствора к каждой колодец. И смешайте содержимое пластины на ротаторе в течение трех минут при 500 вращениях в минуту или до тех пор, пока все скважины не превратились из зеленого в желтый.

Затем прочитайте оптическую плотность образцов и используйте программное обеспечение микро пластины для преобразования уровня кортизола в каждом образце в пикограммы на миллиграмм. В этом репрезентативном анализе уровень кортизола, как правило, выше в образцах плавника, промытых изопропанолом, чем в тех, которые промывают водой, но никаких существенных различий в уровнях фин кортизола не наблюдалось среди видов осетровых. Существенного взаимодействия между стиральными растворителями и осетровыми видами не было.

Изучение кортизола из челюстных кости H.Huso, чтобы определить, могут ли челюстные кости осетровых быть использованы в качестве альтернативной матрицы плавников, показало, что стиральный растворитель не имел существенного влияния на уровень кортизола, измеренный в осетре Х.Хусо. Кроме того, данные показали высокое сходство между плавниками трех проверенных видов осетровых и челюстными костями H.Huso. Важно использовать битер шарика для измельчения образцов в мелкий порошок и использовать соответствующий коммерческий набор ELISA Assay для успешного измерения кортизола.

Этот метод также может быть использован для обнаружения кортизола в зубах и других жестких матриц, как измерения уровня кортизола обеспечивают важную информацию о том, как окружающая среда влияет на биологию животных. Метод может быть использован в качестве нового подхода к оценке уровня кортизола в молочных зубах ребенка человека и в детской эндокринологии, психо биологии, поведенческих, археологических и судебно-медицинских исследований.