Иерархический и программируемый однопотный олигосахаридный синтез
6 сентября 2019 г.
Этот протокол демонстрирует, как использовать программное обеспечение Auto-CHO для иерархического и программируемого синтеза олигосахаридов. В нем также описывается общая процедура экспериментов по определению RRV и гликозилирование SSEA-4.
Мы демонстрируем, как использовать наше недавно разработанное программное обеспечение, Auto-CHO, для иерархического и программируемого синтеза олигосахарида в одном горшке. Auto-CHO включает в себя алгоритмы на расширенных строительных блоках, с относительными значениями реактивности, прогнозируемыми с помощью машинного обучения. Программное обеспечение Auto-CHO обеспечивает ценное руководство для выбора строительного блока, а также иерархический план для нескольких один горшок синтез более сложных гликанов через фрагмент композиции.
Последствия этого метода распространяются на терапию рака или инфекционных заболеваний с помощью терапевтических средств на основе углеводов. Прежде чем использовать Auto-CHO, пожалуйста, убедитесь, что среда Java Runtime была установлена на ПК или Mac. Визуальная демонстрация манипуляций с программным обеспечением Auto-CHO и связанного с ними эксперимента по определению значения реактивности помогут химикам следовать протоколу и быстро приступить к эксперименту.
Для выполнения инициализации программного обеспечения среды Java Runtime перейдите на веб-сайт Auto-CHO и загрузите программное обеспечение в соответствии с операционной системой. В настоящее время Auto-CHO поддерживает Windows, macOS и Ubuntu. Последнее руководство для пользователей PDF представлено на веб-сайте Auto-CHO.
Для пользователей Windows, распаковать Auto-CHO Windows. молнии, и двойной щелчок на Auto-CHO. банку в папке Auto-CHO Windows для запуска программы.
Вввнесите желаемую структуру гликан. Выберите нарисовать структуру гликан или прочитать существующий файл структуры. Чтобы ввести, рисуя, нажмите на редактировать гликан glycanBuilder, или область нажмите здесь, чтобы редактировать синтетическую цель, чтобы нарисовать и отредактировать структуру запроса GlycanBuilder.
Не следует игнорировать информацию о связи и хиральности. Нажмите на кнопки Globo-H, SSEA-4 или OligoLacNAc для отображения примеров. Закройте диалог GlycanBuilder для полного редактирования.
Определите параметры поиска во вкладке параметров, чтобы получить разумные результаты поиска. Нажмите на кнопку "Хорошо", чтобы включить новые настройки. Параметр по умолчанию заключается в поиске только экспериментальной библиотеки.
При желании искать как экспериментальные, так и виртуальные библиотеки, выберите вкладку библиотеки виртуального строительного блока. Выберите использовать экспериментальные и виртуальные библиотеки, а также применять фильтрацию для отображения виртуальных строительных блоков с определенными критериями. Экспериментальные и виртуальные строительные блоки могут работать вместе, чтобы повысить способность к поиску Auto-CHO.
В настоящее время Auto-CHO предоставляет более 50 000 виртуальных строительных блоков, с прогнозируемыми RRVs в библиотеке. Проверьте один или несколько желаемых виртуальных строительных блоков, которые пользователь хотел бы использовать для поиска. Нажмите на выбранной на выставке кнопку виртуальных строительных блоков, чтобы показать только выбранные виртуальные строительные блоки.
Нажмите на кнопку отфильтрованных виртуальных строительных блоков, чтобы показать только виртуальные строительные блоки с определенными критериями, определенными пользователем. Нажмите на кнопку «Показать все виртуальные строительные блоки», чтобы показать все доступные виртуальные строительные блоки и сбросить фильтр. Выберите вкладку структуры запроса и нажмите кнопку библиотеки блока поиска, чтобы найти синтетические решения для структуры запроса.
Затем подтвердите настройки параметра. Поиск результата зрителя. Результат поиска отображается во вкладке визуализации результатов.
В столбце уменьшения конечного приемора различных номеров остатков отображаются в столбце конечных приемов. Далее выберите конечный прием на конец. Решения отображаются в списке синтетических решений.
Фрагменты показаны в списке фрагментов, чтобы предложить, сколько фрагментов должно быть использовано в синтезе. Система предоставляет подробную информацию о каждом фрагменте, включая РРВ фрагмента, вычислительную урожайность, а также о том, какая защитная группа должна быть депротекирована для использования фрагмента в реакции одного горшка. Также отображаются строительные блоки, используемые для сборки выбранного фрагмента, и информация о подключении фрагментов.
Для экспериментальных строительных блоков, просматривать и проверять химические структуры выбранных строительных блоков в химической структуре области строительного блока, а также увидеть подробную информацию строительного блока браузера. В 10-миллилитровой круглой нижней колбе смешайте двух тиогликозидных доноров, абсолютный метанол и ддририт в DCM. Затем перемешать при комнатной температуре в течение одного часа.
Возьмите 30-микролитер aliquot этой смеси и ввести смесь в высокой производительности жидкой хроматографии в три отдельных инъекций. Измерьте коэффициент между поглощением и концентрацией молекулы донора в базовых условиях разделения. Добавьте раствор 0,5 молярного N-Iodosuccinimide в ацетонитриле в реакционной смеси, а затем добавление 0,1 моларного трифторометанесульфонового кислотного раствора.
Перемешать смесь при комнатной температуре в течение двух часов. Затем разбавьте реакционной смесь четырьмя миллилитровами DCM. Фильтр и промыть реакцию с насыщенным аквеозным тиосульфатом натрия, содержащим 10% карбоната водорода натрия.
Теперь извлекайте aqueous слой 3 времени с 5 миллилитров DCM. Смешайте все органические слои и вымойте пятью миллилитров рассола. Затем высушите комбинированные слои примерно 200 миллиграммами сульфата ангидроя магния.
Встряхните смесь мягко в течение 30 секунд, и фильтровать его через воронку с рифленой фильтровальной бумагой для того, чтобы удалить сульфат магния. Затем соберите фильтрат в 25-миллилитровую круглую нижнюю колбу. Удалите растворитель, используя роторный испаритель.
Растворите остаток в одном миллилитре DCM. Возьмите 30-микролитер aliquot этой смеси, и ввести его в высокой производительности жидкой хроматографии в три отдельных инъекций. Измерьте концентрацию остальных доноров HPLC при тех же условиях разделения.
Измерьте относительную реактивность. Исходя из относительного значения реактивности DR4, относительное значение реактивности DX1 составляет три. Результат поиска Auto-CHO, основанный на параметрах параметра по умолчанию, указывает на то, что SSEA-4 может быть синтезирован реакцией два плюс один плюс три.
При выборе эндоприема трисакхарида программа показывает четыре потенциальных решения для запроса. Первое решение имеет один фрагмент, а его расчетная доходность составляет около 94%Фрагмент может быть синтезирован двумя строительными блоками. RRV первого disaccharide строительного блока 1462, и RRV второго monosaccharide 32.0.
Показана также химическая структура первого предложенного строительного блока, используемого в реакции одного горшка. Эксперимент с одним горшком показывает, что SSEA-4 может быть успешно синтезирован в 43%yield этим предложением. SSEA-4 может быть синтезирован тремя единицами, предложенными Auto-CHO.
Эти единицы включают силеле disaccharide строительный блок один, monosaccharide строительный блок два, и сокращение конца приемной три. Для параметров мы предлагаем установить параметры с более строгими критериями в начале. Для выбора библиотеки строительного блока мы предлагаем искать экспериментальную библиотеку только в первую очередь.
Благодаря этой демонстрации, мы надеемся, что более важные гликаны, такие как связанные с опухолью углеводные антигены, могут быть синтезированы одним горшком подход для дальнейших исследований. После этой процедуры, синтез всех таких антигенов может быть выполнен для того, чтобы разработать углеводной основе вакцин против рака. Мы также надеемся, что искусственный интеллект и компьютерные алгоритмы могут облегчить автоматизированный синтез гликан в интересах лечения и профилактики заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе демонстрируется использование программного обеспечения Auto-CHO для иерархического и программируемого однореакторного синтеза олигосахаридов. Он включает визуальную демонстрацию работы с программным обеспечением и эксперименты по определению RRV.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Синтез олигосахаридов
- Разработка программного обеспечения
- Применение машинного обучения
Теоретическая часть
- Программное обеспечение Auto-CHO помогает в синтезе олигосахаридов.
- Алгоритмы предсказывают значения относительной реакционной способности с помощью машинного обучения.
- Приводятся рекомендации по выбору строительных блоков.
- Значение для терапевтического применения при раке и инфекционных заболеваниях.
Цель исследования
- Продемонстрировать функциональность программного обеспечения Auto-CHO.
- Представить протокол одностадийного гликозилирования.
- Облегчить синтез сложных гликанов путем подбора состава фрагментов.
Используемые методы
- Иерархический синтез олигосахаридов.
- Алгоритмы машинного обучения для прогнозирования значений реакционной способности.
- Визуальные демонстрации использования программного обеспечения.
- Эксперименты по определению RRV.
Основные результаты
- Успешная демонстрация одностадийного синтеза олигосахаридов.
- Эффективные рекомендации по выбору строительных блоков.
- Четкие визуальные инструкции для химиков.
- Освещение потенциальных терапевтических применений.
Выводы
- Программное обеспечение Auto-CHO является ценным инструментом для синтеза олигосахаридов.
- Машинное обучение оптимизирует процесс синтеза.
- Данный протокол обеспечивает быстрое выполнение эксперимента.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Программируемый одностадийный синтез олигосахаридов позволяет быстро собирать сложные гликаны для валидации терапевтических мишеней, сокращая сроки разработки перспективных углеводных препаратов. Программное обеспечение Auto-CHO обеспечивает предиктивный выбор строительных блоков и иерархическое планирование синтеза, поддерживая снижение механистических рисков на ранних этапах поиска. Такой подход оптимизирует сортировку портфеля за счет повышения достоверности взаимосвязи «структура — активность» гликанов перед началом доклинических инвестиций.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством быстрого синтеза определенных структур гликанов, таких как SSEA-4, для валидации маркеров стволовых клеток.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет получения гомогенных партий олигосахаридов для анализов по валидации функциональных мишеней.
- Прогностическая ценность: облегчает картирование зависимости «структура — активность» для приоритизации гликановых эпитопов с терапевтическим потенциалом при воздействии на мишени в онкологии и инфекционных заболеваниях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Обеспечивает получение стандартизированных препаратов гликанов, подходящих для создания углеводных микрочипов и разработки анализов связывания.
- Количественные показатели: Обеспечивает измеримый выход и профили чистоты, что позволяет проводить надежный скрининг соединений в отношении гликан-связывающих белков.
- Повторное использование платформы: Позволяет итеративно совершенствовать библиотеки строительных блоков на основе отзывов пользователей о виртуальных блоках, что повышает масштабируемость скрининга в долгосрочной перспективе.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Продемонстрированный синтез SSEA-4, маркера плюрипотентных стволовых клеток, способствует согласованию биомаркеров в регенеративной медицине и при воздействии на раковые стволовые клетки.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от синтеза в исследовательских масштабах к доклинической оценке опухоль-ассоциированных углеводных антигенов для разработки вакцин.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет осуществлять производство гликанов с определенной структурой для снижения неопределенности при профилировании иммунологической эффективности и безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы ранних этапов поиска за счет обеспечения синтеза гликанов на основе выдвинутых гипотез, что способствует идентификации перспективных соединений путем создания определенных антигенных структур и поддерживает доклиническую валидацию благодаря воспроизводимому производству гликанов.
- Биология открытий: способствует снижению механистических рисков путем уточнения биосинтетических путей и валидации гликановых мишеней с помощью направленного химического синтеза.
- Скрининг: позволяет создавать готовые к анализу панели гликанов с количественным определением выхода для высокопроизводительного скрининга взаимодействий гликан-белок.
- Аналитика: предоставляет значения относительной реакционной способности и расчетный выход в качестве количественных показателей для сравнения эффективности путей синтеза и прогнозирования успеха.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклинической работой, позволяя синтезировать опухолеассоциированные углеводные антигены для оценки кандидатов в вакцины.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый ресурс за счет расширения виртуальной библиотеки Auto-CHO на основе обратной связи, что сокращает необходимость в избыточном планировании синтеза в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в функциях гликанов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость синтеза олигосахаридов благодаря стандартизированным однореакторным (one-pot) протоколам.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет возможности быстрого изучения зависимости «структура — активность», что снижает риск неудач на поздних стадиях биологических испытаний.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию кандидатов на основе гликанов с учетом рисков благодаря определенным показателям синтетической доступности и прогнозируемому выходу продукта.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области химии углеводов и интерпретации структуры гликанов для эффективного подбора строительных блоков.
- Необходим доступ к ВЭЖХ и стандартной инфраструктуре органического синтеза для определения RRV и мониторинга реакций.
- Требуется межкомандная стандартизация номенклатуры гликанов и форматов ввода структур для согласованного выполнения запросов в Auto-CHO.
- Потребуется адаптация при расширении списка строительных блоков за пределы тиогликозидов или при использовании альтернативных стратегий введения защитных групп.
- Метод ограничен точностью предсказанных с помощью машинного обучения значений RRV для новых строительных блоков, что требует экспериментальной валидации для получения высокодостоверных прогнозов.
