Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями
20 декабря 2019 г.
Тау является нейрональным белком, присутствующим как в цитоплазме, где он связывает микротрубочки, так и в ядре, где он оказывает нетрадиционные функции, включая модуляцию генов, связанных с болезнью Альцгеймера. Здесь мы описываем метод исследования функции ядерного Тау, исключая при этом любые помехи, исходящие от цитоплазмии Тау.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о прямой роли тау в ядерном отсеке, исключая при этом любое потенциальное цитоплазмическое загрязнение тау. Основным преимуществом этого метода является то, что он широко применим к изучению ядерной функции тау в других типах клеток и в различных клеточных условиях. Демонстрацией процедуры будет Джакомо Сиано, пост-док из моей лаборатории.
Начните с покрытия четыре раза 10 до пяти SH-SY5Y человека нейробластомы клеток линии клеток, которые будут трансфицированы с пустым вектором управления, четыре раза от 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с untagged тау, четыре раза 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с тау-NLS, и четыре раза от 10 до пяти клеток, которые будут трансфицированы с тау-РЭШ в отдельных скважин. На следующий день после покрытия, отдельно инкубировать 400 нанограммов ДНК и соответствующий объем катионых липидов в одну трубку из 250 микролитров уменьшенной сыворотки на колодец. Через пять минут при комнатной температуре смешайте каждый вектор с одним объемом катионых липидов и инкубировать липидные комплексы ДНК в течение 20 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации замените супернатанты в каждом хорошо с двумя миллилитров свежей полной среды культуры и трансфект каждой хорошо с соответствующим раствором липидного комплекса ДНК для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующий день замените супернатанты свежей дифференциацией среды. Для западного анализа пятно, мыть трансфицированных и дифференцированных клеток в каждом хорошо с PBS и инкубировать клетки с 500 микролитров 0,1% трипсина на колодец в течение четырех минут при 37 градусов по Цельсию.
Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с равным объемом полной среды и передачи клеточной подвески из каждого хорошо в отдельные трубы для центрифугации. После тщательного удаления supernatants, повторно гранулы в один миллилитр PBS на трубку для второй центрифугации и удалить supernatants снова. Для общего экстракта белка, инкубировать гранулы в течение 30 минут на льду в 50 до 100 микролитров лиза буфера дополняется протеазы и ингибиторы фосфатазы.
В конце инкубации центрифугировать экстракт в 16 000 раз г в течение 15 минут и количественно оценить концентрацию белка по любым стандартным количественным анализам. Затем смешайте 20 микрограммов каждого образца белка с пятью микролитерами буфера 4X Laemmli общим объемом 20 микролитров и варите образцы при 100 градусах Цельсия в течение пяти минут. Для субклеточной фракциорной, повторного перерасхода клеток в полной среде для подсчета и спина вниз один раз от 10 до шести клеток на образец.
Чтобы изолировать цитозолированную фракцию, инкубируйте гранулы в 100 микролитров буфера ледяной цитоплазмической экстракции, дополненного ингибиторами протеазы при четырех градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 минут. В конце инкубации соберите образцы путем центрифугации и перенесите супернатанты в предварительно охлажденные трубки. Добавьте 100 микролитров буфера извлечения ледяной мембраны, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулам в течение 10 минут инкубации при четырех градусах Цельсия с нежным смешиванием.
Затем центрифугировать гранулы в течение пяти минут при четырех градусах цельсия и 3000 раз г и собирать супернатанты в новые трубки. Чтобы собрать растворимую ядерную фракцию, добавьте 50 микролитров буфера ядерной добычи, дополненных ингибиторами протеазы, к гранулам с вихрем перед инкубацией образцов при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугировать образцы и собирать супернатанты.
Для сбора нерастворимой ядерной фракции добавьте 50 микролитров буфера ядерной добычи, дополненных ингибиторами протеазы, хлоридом кальция и микрококковой нуклеазой к гранулам с вихрем. Инкубировать образцы в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем вихри и центрифугирования. Затем соберите супернатанты.
Для сбора цитоскелетной фракции добавьте 50 микролитров буфера цитоскелетной экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулам с вихрем. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугает образцы и собирает супернатанты. Для анализа SDS-PAGE добавьте семь микролитров буфера 4X Laemmli к 20 микролитров каждого из собранных образцов субклеточной фракции и варите образцы при 100 градусах цельсия в течение пяти минут.
В конце инкубации загрузите образцы на акриламидный гель и выполните электрофорез при постоянном напряжении 120 вольт. Затем перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы на 250 миллиампер в течение 90 минут. Инкубировать мембрану в течение пяти минут в Ponceau окрашивания раствор, чтобы проверить на наличие надлежащего белка гель электрофорез и успешное blotting.
В конце инкубации, промыть мембрану в дистиллированной воде, пока фон не будет чистым и удалить пятно с непрерывной стирки с Трис-буфер соленый дополняется Tween 20 в течение 10 минут на шейкере. Далее, инкубировать мембрану с блокирующим раствором в течение одного часа при комнатной температуре с встряхивания перед стиркой три раза с Tris-буферный солевой плюс Tween 20 в течение пяти минут за стирку. После последней стирки, гибридизировать мембрану с основным антителом интерес в блокировании раствора на ночь при четырех градусах по Цельсию, а затем три моет с Трис-буфер соленый плюс Tween 20 в течение пяти минут.
После последнего мытья, гибридизировать мембрану с соответствующим хреном пероксиды спряженных вторичных антител в блокировании раствора в течение одного часа при комнатной температуре перед мытьем мембраны с Трис-буферный солевой плюс Tween 20 три раза в течение пяти минут за стирку. После последней стирки, обнаружить белковую полосу с помощью хемилюминесценции и количественно интенсивность западных полос пятно ImageJ. При отсутствии ретинойной кислоты и нейротрофического фактора, полученного мозгом, недифференцированные клетки SH-SY5Y предполагают более круглую морфологию и образуют клеточные комки.
Как и ожидалось, после пяти дней лечения ретинойной кислотой, сгустки расслабиться и клетки распространяются. После трех дополнительных дней лечения нейротрофическим фактором, полученным мозгом, клетки появляются равномерно распределенными и взаимосвязанными через сеть разветвленных невритов. После тау-NLS или тау-РЭШ трансфекции, тау субклеточной локализации могут быть обнаружены иммунофторесценции с анти-тау антител.
В зависимости от эффективности трансфекции, клетки отображают сильное ядерное окрашивание, сливаясь с сигналом DAPI после трансфекции тау-NLS или цитоплазмического окрашивания пустыми ядрами после тау-РЭШ. Западный анализ помарки показывает обогащение актина в цитоскелетной фракции, тубулина в цитоплазмических и цитопскелетных фракциях и H2B в ядерных фракциях. Западный анализ пятно также подтверждает выражение помечены и untagged тау в ядерном отсеке и везикулярного глутамата транспортер одно выражение в общем экстракте.
Действительно, соотношение тау в растворимых ядерных и цитоплазмических фракциях подчеркивает тот факт, что тау-НЛЛ в значительной степени обогащается в растворимой ядерной фракции, в то время как тау-РЭШ снижается. Кроме того, тау-НЛЛ обогащается в фракции хроматина по отношению к цитоплазмической фракции, в то время как тау-РЭШ снижается. Обязательно проверьте количество клеток, используемых для фракции каждого образца, и проверьте обогащение генов домашнего хозяйства в соответствующих фракциях.
После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изолировать сотовые отсеки и оценить функциональную роль тау в ядре.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод исследования роли ядерного Tau — белка, участвующего в развитии болезни Альцгеймера, при одновременном исключении влияния цитоплазматического Tau. Данный метод применим для различных типов клеток и условий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования болезни Альцгеймера
Теоретическая часть
- Tau — это нейрональный белок, участвующий в связывании микротрубочек.
- Он обладает нетрадиционными функциями в ядре.
- Ядерный Tau может модулировать гены, связанные с болезнью Альцгеймера.
- Понимание его роли имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий.
Цель исследования
- Для исследования функции ядерного Tau без загрязнения цитоплазматическим содержимым.
- Для предоставления широко применимого метода изучения Tau в различных клеточных контекстах.
- Для более глубокого понимания роли Tau в нейродегенеративных заболеваниях.
Используемые методы
- Трансфекция клеток нейробластомы человека SH-SY5Y различными конструктами Tau.
- Использование катионных липидов для доставки ДНК.
- Инкубация ДНК-липидных комплексов для обеспечения трансфекции.
- Изоляция ядерного Tau для функционального анализа.
Основные результаты
- Метод успешно исключает загрязнение цитоплазматическим Tau.
- Он позволяет напрямую изучать функции ядерного Tau.
- Продемонстрирована применимость к различным типам клеток и условиям.
- Метод дает представление о роли Tau в модуляции генов, связанных с болезнью Альцгеймера.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для изучения ядерного Tau.
- Он открывает новые возможности для исследования нейродегенеративных заболеваний, связанных с белком Tau.
- В будущих исследованиях этот метод можно использовать для изучения разнообразных функций Tau.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет точно исследовать функцию ядерного Tau в экспрессии генов, восполняя критический пробел в валидации мишеней при болезни Альцгеймера. Изолируя ядерный Tau от влияния цитоплазматической фракции, этот подход способствует механистическому снижению рисков при изучении Tau-зависимых транскрипционных путей. Данный метод представляет собой масштабируемый и универсальный инструмент для оценки модуляции связанных с заболеванием генов в нейрональных моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное выявление и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет напрямую оценить роль ядерного Tau в модуляции связанных с заболеванием генов, таких как VGluT1.
- Практическая ценность: используются стандартные методы трансфекции и фракционирования, совместимые с существующими рабочими процессами в нейробиологии.
- Стратегическая ценность: снижает вероятность ошибочного приписывания эффектов экспрессии генов цитоплазматическому Tau, что повышает достоверность определения мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить количественные данные о субклеточном фракционировании для корреляции локализации Tau с экспрессией целевых генов.
- Практическая ценность: использует надежные классические методы (лизис, центрифугирование, вестерн-блоттинг), пригодные для стандартизации анализа.
- Стратегическая ценность: способствует разработке воспроизводимых показателей активности ядерного Tau в каскадах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает ядерный Tau с путями высвобождения глутамата, имеющими значение для патофизиологии ранних стадий болезни Альцгеймера.
- Практическая ценность: Применимо к различным типам клеток и условиям, что способствует трансляционной согласованности.
- Стратегическая ценность: Позволяет проводить оценку стратегий таргетирования Tau с учетом рисков за счет выяснения ядерного механизма.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применим в рамках начальных этапов поиска новых лекарственных средств, когда для валидации мишени требуется четкое понимание механизмов функционирования ядерных белков, особенно в моделях нейродегенеративных заболеваний.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез о роли ядерного Tau в транскрипционной регуляции, снижая неопределенность механизмов.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу субклеточные фракции для количественной оценки Tau-зависимой модуляции генов.
- Аналитика: обеспечивает получение данных методом вестерн-блоттинга об обогащении ядра белком Tau и экспрессии целевых генов (например, VGluT1) для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает функцию ядерного Tau с экспрессией генов, значимых при заболеваниях, в нейрональных моделях, обеспечивая преемственность доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: состоит из широко применимых методов, что позволяет использовать их в различных исследованиях Tau в разных клеточных контекстах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение уверенности в предсказании функциональной роли ядерного Tau, уменьшение механистической неопределенности в регуляции генов.
- Практическая ценность: Стандартизация за счет использования классических, надежных методов; воспроизводимость с помощью контролей фракционирования.
- Стратегическая ценность: Обоснование более точных решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) путем изоляции специфических ядерных эффектов, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ, нацеленных на Tau.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного ядерного механизма действия.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области трансфекции клеток млекопитающих, субклеточного фракционирования и вестерн-блот-анализа.
- Необходим стандартный набор оборудования: центрифуги, системы гель-электрофореза и хемилюминесцентные детекторы.
- Требуется стандартизация протоколов фракционирования между исследовательскими группами для обеспечения чистоты фракций.
- Адаптация метода для первичных нейронов или других моделей может потребовать оптимизации условий трансфекции и лизиса.
- Практическое ограничение: эффективность зависит от успеха трансфекции и надлежащей валидации маркеров фракций (например, H2B, actin, tubulin).
