Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши
17 декабря 2019 г.
Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.
Сердце содержит неоднородную популяцию иммунных клеток, которые играют решающую роль в сердечном воспалении, а также в ремонте. Для того, чтобы понять неоднородность иммунных клеток и получить дальнейшее представление об их функции, важно иметь метод, который позволит для восстановления этих клеток из сердца. Этот метод может помочь раскрыть иммунной, а также неиммуне клеточного разнообразия, которое находится в здоровом или больном сердце.
Есть три основных преимущества этой техники. Во-первых, это простой рабочий процесс, который приводит к генерации одноклеточной подвески различных типов клеток в течение трех часов времени. Во-вторых, это приводит к высокому восстановлению жизнеспособных иммунных и неиммунных популяций клеток.
И в-третьих, это очень универсальный метод и может быть применен к тканям сердца в других видах, а также. Важно обращать внимание на количество тканей, используемых для одной реакции пищеварения. Используйте стерильные ножницы, рассекаете образец ткани из апической или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS.
Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и chordae tendineae из образца. С помощью стерильного лезвия или ножниц, вскрыть куски ткани на куски весом около 200 миллиграммов. После усыпания мыши откройте грудную полость с помощью острых ножниц.
Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Perfuse сердце с холодным PBS с помощью 25 калибровочных иглы прилагается к пяти миллилитров шприц. Пронизыть, пока сердце не появится бланшированный цвет.
Удалите сердце и поместите его в стерильную чашку Петри на льду. Поместите 200 миллиграммов кусков сердечной ткани человека или муринового сердца в стерильную чашку Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.
Чтобы настроить пищеварения, в 15 миллилитров конической трубки, подготовить окончательный объем пищеварения в три миллилитров для каждого человека сердечной ткани кусок или один мурин сердце с ферментами коллагеназы I, DNase I, и гиалуронидазы в концентрациях 450, 60 и 60 единиц на миллилитр. Добавьте в трубку 2,5 миллилитров DMEM. С помощью чистых типсов поместите мелко рубленую ткань в каждую реакционной трубку.
Хорошо перемешать нежным вихрем. Дайджест в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию в трясущимся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения. После одного часа пищеварения вывихни трубки из инкубатора и поместите на лед.
Установите 50 миллилитров конических трубок с 40 микрон-клеточный ситечко на вершине. Влажные фильтры с двумя миллилитров фермента деактивации буфера. Затем деактивировать ферменты пищеварения, добавив восемь миллилитров фермента деактивации буфера для каждой трубки пищеварения.
Затем залить в результате 13 миллилитров общей смеси через 40 микрон клеток ситечко в 50 миллилитров конических труб. Перенесите отфильтрованные образцы обратно в свежие 15 миллилитровых конических трубок. Спин образцов на 400 раз g в течение шести минут при четырех градусах по Цельсию.
Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 миллилитров мультимедиа. Resuspend гранулы клетки нежным pipetting и добавить один миллилитр буфера лиза ACK. Нежный вихрь трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут для выполнения лиза красных кровяных телец.
После пяти минут в буфере ACK добавьте в образец девять миллилитров DMEM. Положите крышку обратно на трубы и осторожно инвертировать трубки для смешивания. Фильтр через 40 микрон клеток ситечко и собирать фильтрат в 15 миллилитров конических труб.
Центрифуга труб на 400 раз г в течение шести минут и отказаться от супернатанта. Добавьте один миллилитр буфера FACS и перерасходуйте гранулы. Затем перенесите его в 1,5 миллилитр микроцентрифуг трубки.
Центрифуга снова при 400 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 100 микролитров буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашивания антител.
Добавьте типичную человеческую панель антител к образцам сердца при разбавлении от одного до 50. Используйте различные антитела для стромальных клеток и макрофагов сердца мурина. Инкубировать в течение 30 до 40 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте.
Добавьте один миллилитр буфера FACS, аккуратно вихрь и центрифугу при 400 раз г в течение пяти минут. Повторите этот шаг стирки во второй раз. Затем повторно посовещение образца в 350 микролитров буфера FACS и добавить DAPI для достижения окончательной концентрации одного микромолара.
В настоящее время образцы готовы к анализу FACS. В этом протоколе была достигнута изоляция макрофагов от мыши и миокарда человека. На этом рисунке показано необработанного и обработанного ядра LVAD человека.
Была представлена схема сортировки потока отрицательных и CCR2 положительных человеческих макрофагов из миокарда человека, а также для CD45 отрицательных стромальных клеток из ишемической кардиомиопатии человека. Изображения Райт окрашенных FACS отсортированы CD45 положительные и CD45 отрицательные клетки показывают нетронутыми клеточной мембраны, указывающие на жизнеспособность. Схема вымывания макрофагов из сердца мыши также была успешной.
Вес ткани, используемой для энзиматической реакции, имеет решающее значение для эффективного пищеварения. Используйте не более 200 миллиграммов ткани для концентрации ферментов, указанных в протоколе. Следуя этому методу, клетки могут быть выуфсяты для анализа стимуляции in vitro.
Клетки могут быть отсортированы для массового секвенирования РНК или секвенирования одной ячейки. Этот метод послужил бесценным методом в открытии ранее непризнанной неоднородности макрофагов, которая присутствует в здоровом или больном человеческом сердце. Используя этот метод с последующим одноклеточным секвенированием, проводятся исследования, чтобы выяснить, как различные иммунные и неиммунические клетки варьируются от больного сердца по сравнению со здоровым сердцем.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод выделения различных подмножеств макрофагов и неиммунных клеток из миокарда человека и мыши. Путем подготовки суспензии единичных клеток с помощью ферментативного переваривания исследователи могут глубже изучить гетерогенность иммунных клеток при воспалении и восстановлении сердечной ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сердечно-сосудистой системы
- Иммунология
Теоретические сведения
- Сердце содержит разнообразную популяцию иммунных клеток.
- Эти клетки играют важнейшую роль в воспалении и восстановлении тканей сердца.
- Понимание их гетерогенности необходимо для изучения здоровья сердца.
- Данный метод помогает выделить из сердца как иммунные, так и неиммунные клетки.
Цель исследования
- Выделение и характеристика макрофагов и других типов клеток из миокарда.
- Выявление разнообразия иммунных и неиммунных клеток в здоровом сердце и сердце при патологиях.
- Предоставление надежного метода для изучения иммунных ответов сердца.
Используемые методы
- Ферментативное расщепление для подготовки суспензий одиночных клеток.
- Проточная цитометрия для идентификации и характеристики клеток.
- Изоляция различных типов клеток из миокарда человека и мыши.
- Простой рабочий процесс, выполняемый в течение трех часов.
Основные результаты
- Высокий выход жизнеспособных популяций иммунных и неиммунных клеток.
- Эффективная изоляция субпопуляций макрофагов.
- Продемонстрированная гетерогенность иммунных клеток в тканях сердца.
- Обеспечение базы для дальнейших исследований механизмов воспаления и восстановления миокарда.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для кардиологических исследований.
- Он углубляет понимание роли иммунных клеток в поддержании здоровья сердца.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для изучения сердечных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Понимание гетерогенности макрофагов в сердечной ткани имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в процессе разработки сердечно-сосудистых лекарственных препаратов. Данный протокол обеспечивает воспроизводимое выделение иммунных и стромальных подмножеств клеток из миокарда человека и мыши, что позволяет проводить механистические исследования для подтверждения достоверности мишеней и приоритизации портфеля разработок. Простота метода и его применимость к разным видам обеспечивают трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции подмножеств макрофагов в путях воспаления и восстановления сердечной ткани.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный рабочий процесс выделения жизнеспособных иммунных и неиммунных клеток с минимальной повседневной вариабельностью.
- Стратегическая ценность: способствует валидации мишеней на основе гипотез путем уточнения клеточного вклада в фенотипы заболеваний.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать очищенные популяции клеток, подходящие для функциональных анализов и последующих омиксных исследований.
- Практическая ценность: Обеспечивает высокий выход жизнеспособных клеток в рамках трехчасового рабочего процесса, что позволяет стандартизировать проведение анализа.
- Стратегическая ценность: Способствует масштабируемой подготовке биологических систем, релевантных конкретным заболеваниям, для скрининга соединений и изучения взаимодействия с мишенями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет проводить прямое сравнение профилей иммунных и стромальных клеток в здоровых и больных сердцах человека.
- Практическая ценность: совместимость с методами массового и одноклеточного секвенирования РНК для поиска биомаркеров и снижения механистических рисков.
- Стратегическая ценность: поддержка принятия обоснованных решений по продвижению исследований с учетом рисков путем установления связи между клеточными фенотипами и состояниями заболевания у разных видов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до доклинических исследований, позволяя изолировать механистически значимые типы клеток для функционального и геномного анализа.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем выделения определенных субпопуляций макрофагов и стромальных клеток.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные жизнеспособные клеточные суспензии, подходящие для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных для проточной цитометрии, секвенирования и функционального анализа, что позволяет проводить сравнительный анализ условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты фундаментальных исследований с доклиническими этапами за счет применимости к разным видам и использования образцов, имеющих значение для конкретного заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для иммунного профилирования в различных моделях сердечно-сосудистых заболеваний и терапевтических областях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет снижения механистической неоднозначности при изучении иммуноопосредованной патологии сердца.
- Операционная ценность: Обеспечение воспроизводимости и масштабируемости благодаря простому и эффективному с точки зрения временных затрат рабочему процессу.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего снижения биологических рисков для сердечно-сосудистых мишеней.
- Влияние на портфель: Возможность приоритизации с учетом рисков на основе валидированных клеточных механизмов в моделях заболеваний человека и мыши.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области ферментативной диссоциации тканей, проточной цитометрии и работы со стерильными культурами клеток.
- Необходим доступ к коллагеназе I, ДНКазе I, гиалуронидазе, лизирующему буферу ACK и оборудованию, совместимому с FACS.
- Требуются стандартизированные протоколы препарирования тканей (например, фрагменты верхушки/боковой стенки левого желудочка массой 200 mg) для обеспечения эффективности переваривания.
- Требуется адаптация панелей антител для видоспецифических маркеров макрофагов и стромальных клеток (например, CCR2 для человека, CD45 для мышей).
- Результат ограничен качеством и количеством исходной ткани; при использовании фиброзных или кальцинированных образцов возможен субоптимальный выход клеток.
