Name: Дизайн, синтез и фотохимические свойства clickable Caged соединений (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Изучите синтез модульных фотоклеточных соединений с кликабельными группами для нейронауки. Этот метод позволяет добавить водорастворимость и клеточное таргетирование без потери фоточувствительности.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI грант номер JP16H01282 (TF), Грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям "Память Динамизм", и JP19H05778 (TF), "MolMovies".

Нам нечего раскрывать.

Ранее мы разработали Bhc клетке соединений различных биологически активных молекул, которые демонстрируют высокую фотолитической эффективности28,45,46,47. С целью расширения репертуара Bhc кэширования групп, мы также сообщили платформ модульных соединений клетке, которые могут быть легко изменены путем введения различных функциональных единиц32,40,41. Таким образом, настоящий протокол представляет собой метод синтеза кликабельного предшественника групп кэширования Bhc, которые могут быть изменены с помощью меди (I)-катализированной циклизации Huisgen. Синтез кликабельного предшественника, paBhcCH2OH (2), был достигнут с помощью четырехступенчатой последовательности реакции, начиная с коммерчески доступного 4-броморзорсинола(рисунок 1A). Преимущество настоящего протокола заключается в том, что не требуется никаких трудоемких шагов очистки (например, хроматографических сечения столбцов).
Как кликабельный предшественник paBhcCH2OH (2) может быть использован для маскировки различных функциональных групп, кликабельные клетки соединений аминов, спиртов и карбоксиловатых кислот были синтезированы с помощью 2 в качестве предшественника (Рисунок 1B). Амины были изменены как их carbamates в то время как спирты были изменены как их карбонаты. В общих процедурах 1 и 2 CDI использовался для приготовления кликабельных карбаматов, а для приготовления карбонат использовался 4-нитрофениловый хлоророформат. Как указывается в механизме реакции, оба реагента могут быть использованы для приготовления карбаматов и карбонат. Следует также отметить, что выход желаемого соединения в клетке зависит от химической структуры молекулы, которая будет в клетке. Другие примеры можно увидеть в наших предыдущих докладах28,30,33,48.
Нажмите модификация была выполнена с использованием небольшой модификации сообщили процедуры49. Добавление трис (триазолметил) амин основе лиганды необходимо для получения желаемых продуктов в хорошем к высоким урожаям. Поскольку различные азиды легко доступны как из коммерческих источников, так и из литературных процедур, мы можем подготовить различные модульные соединения клетке с дополнительными свойствами, такими как растворимость воды и клеточной способности ориентации (Рисунок 2).
Квантовый выход фотолиза затем измеряется в соответствии с процедурой28,50. На рисунке 3 показано, что фотолитическое потребление 2-glc-paBhcmoc-PTX и выпуск PTX были приближены к одноэкспоненциальному распаду и росту, соответственно, предполагая отсутствие внутренней фильтрации радиации или нежелательных вторичных эффектов. Улучшенный фотолиза квантовых урожаев() и фотолиза эффективности() были отмечены для кликабельных paBhc клетке соединений по сравнению с ранее сообщалось Bhc клетке соединений (Таблица 1)41, 43. Так как эффективность фотолиза() из Bhc клетке соединений более чем в сто раз выше, чем у 2-nitrobenzyl типа клетчатых соединений48, заметное улучшение в связи с наличием paBhc caging группы явно преимущество для этой системы.
В качестве доказательства концепции эксперимента, гидрофильные moiety был введен в 2 "-paBhcmoc-PTX (4) и клеточного таргетинга лиганд был введен в соединение 3 (Рисунок 2). Растворимость воды 2'-glc-paBhcmoc-PTX была в 650 раз выше, чем у материнского PTX(таблица 1). Селективная клеточная ориентация была достигнута с помощью системы тегов-зондов, и paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8)подшипник лиганд HaloTag был успешно направлен на клеточную мембрану культивированных клеток млекопитающих, выражающих белок синтеза HaloTag/EGFR ( Рисунок 4). Фото-опосредованный модуляции субклеточной локализации киназы также была достигнута с помощью кликабельного соединения клетки 5 (рисунок 5).
В заключение мы успешно продемонстрировали метод подготовки кликабельных платформ для фотоклеточных соединений биологически интересных молекул, которые могут быть легко модифицированы с дополнительными свойствами, такими как растворимость воды и клеточная ориентируясь на способность. Так как группа кэша paBhc может быть использована для подготовки любых молекул с изменяемыми функциональными группами, применение настоящего протокола не ограничивается молекулами, описанными в настоящем. Используя модульную платформу, а именно группу кэша paBhc, нужные соединения в клетке могут быть легко подготовлены, а их физические и химические свойства можно модулировать с помощью изменения кнопки.

Клетчатые соединения предназначены синтетические молекулы, первоначальные функции которых временно маскируются коваренными фото-съемными группами защиты. Интересно, что клетки соединений биологически значимых молекул обеспечивают незаменимый метод для пространственно-временного контроля клеточной физиологии1,2,3,4,5 ,6. В 1977 году Энгельс и Schlaeger сообщили 2-нитробензил эстер CAMP как мембраны проницаемой и фотолабильной производной cAMP7. В следующем году Каплан сообщил 1-(2-нитрофенил) этиловый эфир АТФ (NPE-ATP) и назвал это соединение "клеткой" АТФ8. С тех пор, ряд фотохимически съемных групп защиты, таких как 2-нитробензилы, р-гидроксифенациклы9, 2-(2-нитрофенил) этил10,11, 7-нитроиндолин-1-yls12 , 13, и (кумарин-4-ил) метилов14,15,16 были использованы для подготовки клеточных соединений.
Ожидается, что синтез соединений в клетке с желательными дополнительными свойствами, такими как проницаемость мембраны, растворимость воды и способность клеточного таргетинга, облегчат лечебное биологическое применение. Поскольку физические и фотохимические свойства этих молекул зависят в первую очередь от химической структуры фотохимически съемных защитных групп, используемых для их подготовки, требуется разнообразный репертуар фото-групп. Однако структурное разнообразие имеющихся в настоящее время кэш-групп, демонстрирующих высокую эффективность фотолиза, ограничено. Это может стать препятствием для увеличения использования соединений, налетемых в клетках.
Для решения этой проблемы репертуар фото-групп пополнился химической модификацией существующих фоторедвижутных защитных групп или дизайном новых фотолабильных хромофор с превосходными фотофизическими и фотохимическими свойствами. Примеры включают нитродибензоврана (NDBF)17, No 3-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)-2-бутил" (DMNPB)18,19, кальций чувствительных 2-nitrobenzyl фотоклетка20, заменить coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-азетидинил-4-метилкумарин23, и styryl coumarins24), цианина производных (CyEt-пан)25, и БОДИПИ производные26,27.
Кроме того, мы ранее разработали (6-бромо-7-гидроксикумарин-4-ил) метил (Bhc) группы и успешно синтезировали различные клетки соединений нейротрансмиттеров28, второй посланников29,30, и oligonucleotides31,32,33 выставке больших одно- и двухфотонных возбуждения поперечных сечений. Если дополнительные свойства могут быть легко установлены в кэш-группы без ущерба для их фоточувствительности, то репертуар клетчатых соединений может быть расширен34,35,36, 37,38,39. Поэтому мы разработали модульные соединения в клетке, которые состоят из трех частей, а именно группы Bhc в качестве фото-реакционный ядро, химические ручки для установки дополнительных функций, и молекулы, которые должны быть замаскированы40, 41.
Таким образом, данная статья предоставляет практический метод для подготовки клеточных соединений биологически значимых молекул. В настоящем протоколе описываются методы подготовки кликабельной платформы для фото-групп, внедрения дополнительных функций для расширения репертуара соединений в клетке, измерения их физических и фотохимических свойства, и клеточного типа селективного таргетинга кликабельного соединения клетки для дальнейшего применения клеток.

<table><tbody><tr><td>ацетонитрил, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>ацетонитрил, супер обезвоженный</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>антибиотик-антимикотик, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-броморесорцинол</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-карбонилдиимидазол</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>хлороформ</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>Пентагидрат сульфата меди (II), 99,9%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>дихлорметан, обезвоженный</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-диметиламинопиридин</td><td>TCI Chemicals</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>диметилсульфоксид, обезвоженный -</td><td>супер-Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - модифицированный Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>флуоресцентный осветитель с двойным источником света, IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Этанол (99,5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>этил4-хлорацетоацетат</td><td>TCI Химикаты</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>Ветчина F-12 с L-глютамином и феноловым красным</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>соляной кислотой</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>инвертированный флуоресцентный микроскоп IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>изолюточный фазовый сепаратор, 15 мл</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-аскорбиновая кислота натриевая соль</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>лазерная сканирующая флуоресцентная конфокальная микроскопия, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Липофектамин 2000 Реактив для трансфекции</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>реагент для липофекции</td></tr><tr><td>3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-нитрофенилхлорформиат (4-NPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Восстановленная сывороточная среда, без фенола красного</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>восстановленная сывороточная среда не содержит фенола</td></tr><tr><td>красного 1,10-фенантролина моногидрат</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>Фотохимический реактор с RPR 350 нм лампами</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Триоксалатоферрат калия (III) тригидрат</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ацетат натрия Тригидрат</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>Бикарбонат натрия</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Серная кислота, 96-98%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (THPTA)</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>три-цитрата натрия дигидрат</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>Ксеноновый свет источник, MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Дизайн, синтез и фотохимические свойства clickable caged соединений

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Клетки соединений позволяют фото-опосредованные манипуляции физиологии клеток с высоким пространствентемспоральным разрешением. Тем не менее, ограниченное структурное разнообразие имеющихся в настоящее время кэш-групп и трудности в синтетической модификации без ущерба для их фотолиза эффективности являются препятствиями для расширения репертуара клетки соединений для живых клеток Приложений. Поскольку химическая модификация фото-кэширующих групп типа кумарин является перспективным подходом для подготовки клетчатых соединений с разнообразными физическими и химическими свойствами, мы сообщаем о методе синтеза кликабельных соединений, которые могут быть изменены легко с различными функциональными блоками через медь (I)-катализированная циклизация Huisgen. Молекула модульной платформы содержит (6-бромо-7-гидроксикумарин-4-ил) метил (Bhc) группу в качестве фото-группы, которая демонстрирует высокую эффективность фотолиза по сравнению с обычными 2-нитробензилами. Представлены общие процедуры приготовления кликабельных соединений, содержащих амины, спирты и карбоксилаты. Дополнительные свойства, такие как растворимость воды и способность таргетинга клеток, могут быть легко включены в кликабельные соединения в клетке. Кроме того, были измерены физические и фотохимические свойства, включая квантовый выход фотолиза, которые, как было установлено, превосходят соответствующие соединения ВХК. Поэтому описанный протокол можно рассматривать в качестве потенциального решения проблемы отсутствия структурного разнообразия в имеющихся соединениях, содеяненные в клетках.

Кликабельные клетки соединений некоторых биологически интересных молекул, в том числе арахидоновой кислоты и паклитакселя, были успешно синтезированы(Рисунок 1)28,41. Дополнительные свойства, такие как растворимость воды и клеточной способности ориентации были введены в paBhcmoc-PTX через медь (I)-катализированная циклизация Huisgen ("Нажмите" реакция) (Рисунок 2). Эти кликабельные клетки PTXs были затем photolyzed производить их родителей PTXs при облучении на 350 нм (Рисунок 3), и физические и фотохимические свойства кликабельных соединений клетке суммируются в таблице 1. Квантовые урожаи кликабельных соединений в клетке 2'-glc-paBhcmoc-PTX(Nodis 0.14) и paBhc-AA(Nodis 0.083) были более чем в два раза выше, чем у обычных соединений Bhc в клетке 2'-Bhcmoc-PTX( 0.040) и Bhc-AA(Nodis 0.038)43. Кроме того, улучшение растворимости воды наблюдалось в течение 2-глк-paBhcmoc-PTX, который содержит глюкозу moiety.
В экспериментах с живыми клетками, ориентация paBhc-hex-FITC/Halo к культивированным клеткам млекопитающих преходяще выражая протеин сплавливания протеина HaloTag и приемного устройства фактора роста эпидермального (EGFR) была достигнута успешно. Зеленая флуоресценция флуоресценции moiety paBhc-hex-FITC/Halo наблюдалась на клеточной мембране(рисунок 4). Фото-опосредовано модуляция субклеточной локализации киназы была достигнута с помощью paBhc клетке соединения. Сообщается, что транслокация диацилицерол киназы (ДГКЗ) активируется при наличии арахидоновой кислоты (АА)44. Клетки CHO-K1, временно выражающие GFP-DGK, лечились либо АА, либо paBhc-AA(5). Добавление АА вызвало модуляцию субклеточной локализации ДГКЗ(рисунок 5A,B). Аналогичные изменения в локализации ДГКЗ наблюдались в клетках, обработанных paBhc-AA, после воздействия УФ-излучения(рисунок 5C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Рисунок 1: Подготовка кликабельных соединений в клетке. (A) Реагенты и условия: a. этил 4-хлороацетоацетат/конк. H2SO4/rt/7 дней/91% урожайность, b. 1 M HCl/reflux/3 дня/97% урожайность. c. N-метилпропаргиламин /HCHO/EtOH, затем добавить (1) и тепла при рефлюксе для 17 h/79% урожайности. (B) Синтезы кликабельных клетке амина, PTX, и арахидоновой кислоты. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Рисунок 2: Установка функциональных блоков в кликабельные соединения в клетке. (A) Синтез водорастворимых клетке PTX через медь (I)-катализированный циклизации Huisgen. (B) Структуры кликабельных соединений клетке, содержащей лиганд HaloTag для клеточного таргетинга. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Рисунок 3: Фотолиз 2-glc-paBhcmoc-PTX (6). Образцы (10 мкм) в растворе K-MOPS (pH 7.2) были облучены на 350 нм. (A) Типичные следы HPLC для фотолизиса 6 (измеряется на 254 нм). Образцы были проанализированы в указанное время облучения. (B) Курс времени для фотолиза 6. Синие круги показывают потребление 6. Твердая линия показывает наименее квадратов кривой подходит для простого распадающихся экспоненциальных для 6. Красные квадраты показывают доходность PTX. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Рисунок 4: Флуоресценция изображения культивированных клеток млекопитающих, инкубированных paBhc-hex-FITC/Halo (8). Клетки, трансфицированные pcDNA3-Halo-EGFR, были инкубированы раствором 2 мкм соединения 8 при 37 градусах По цельсии в течение 30 мин. Изображения были получены после повторного мытья с помощью PBS. Mock-обработанные клетки HEK293T (A:дифференциальный контраст интерференции (DIC) изображение и D: изображение флуоресценции). HeK293T клетки(B и E)и Клетки HeLa(C и F)преходяще выражая Halo-EGFR (B и Cизображения DIC и E и F: изображения флуоресценции). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Рисунок 5: Флуоресценция изображения после УФ облучения cho-K1 клеток инкубировали с Bhc клетке арахидоновой кислоты. Клетки ЧО-К1 были трансфицированы синтезированным белком ДГКЗ-ЭГПп. (A) Флуоресценция изображение трансинфицированных клеток. (B) 100 с после добавления раствора 10 км арахидоновой кислоты. (C) Клетки были инкубированы с раствором 10 км paBhc-AA (5) при 37 КК в течение 5 мин. (D) 100 с после 20-х УФ облучения (330-385 нм). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Соединений</td>
			<td>макс (нм)a
</td>
			<td>макс (M-1 см-1)b
</td>
			<td>вопросо дис-с
</td>
			<td>d-d
</td>
			<td>Растворить (ММ)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Бхк-АА</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Физические и фотохимические свойства кликабельных соединений в клетке. a. Максимум абсорбции (нм), b. Молярная абсорбтивность на уровнемакс (M1 смNo1),c. Квантовая урожайность исчезновения исходных материалов при 350 нм, д. Продукт молярной абсорнтивности и квантовой урожайности исчезновения на уровне 350 нм, э. Концентрация насыщенного раствора в K-MOPS (pH 7.2) (мкгмлЛ No1).

Представлен протокол синтеза и измерения фотохимических свойств модульных соединений в клетке с помощью кликабельных муати.

Дизайн, синтез и фотохимические свойства clickable Caged соединений

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить практический метод для подготовки фотокомедийных соединений с дополнительными свойствами, такими как вода solubility или клеточной ориентации способности. Используя простую синтетическую процедуру, этот метод может быть использован для расширения лаборатории над клетками соединений и сделать в клетке соединений с дополнительными свойствами без ущерба для их фоточувствительности. Этот синтез может быть выполнен в стандартной лаборатории, как наши интерактивные клетке соединений стабильны для фото-облучения при растворении в не-нуклеофильных органических растворителей, таких как дихлорметан или диметил сульфоксид.Демонстрацией процедуры с Хироной Сасаки будут Акинобу Судзуки, постдок, Ханами Аоки и Рей Ватахики, аспиранты из лаборатории. Начните с добавления 709,6 миллиграммов метанола paBhc и 397,6 миллиграммов n n-carbonyldiimidazole в 30-миллилитровую колбу с круглым дном. Добавить сухие шесть миллилитров дихлорметана в колбу и перемешать раствор при температуре окружающей среды в течение одного часа.В конце инкубации добавьте 342,8 миллиграмма 4-диметиламинопиридин и 552 микролитера терт-бутила шести аминокислотный карбамат и перемешайте раствор при температуре окружающей среды еще три часа. Затем используйте роторный испаритель под вакуумом, чтобы удалить растворитель и другие летучие материалы, и использовать кремнезем гель флэш-колонки хроматографии для очистки остатков непосредственно. Чтобы установить функциональный блок в щелкаемой клетке соединения, растворить 249 миллиграммов меди два сульфата пентагидрата в 10 миллилитров ионно-обменной воды, чтобы дать 0,1 моларного медного сульфата раствора.Растворите восемь миллиграммов двух основных paBhc макет paclitaxel, 7,5 миллиграммов трис (3-гидроксипропилтриазолилметил)амин, 162,4 миллиграмма натрия-л-аскорбата и 3,1 миллиграмма 15-хлоро-3, 6, 9-триоксипентилдецидецида в смешанном растворители 2,5 миллилитров 0,1 молар фосфатного буфера и 0,5 миллилитров диметилсулфоксида. Затем добавьте 81,2 микролитера 0,1 молярного раствора сульфата меди в реакционной смеси и перемешайте смесь при температуре окружающей среды в течение 80 минут, отслеживая ход реакции с помощью HPLC. В конце реакции, решить обрывистов с 3,5 миллилитров 75%ацетилнитрилового раствора воды и применить результирующее решение непосредственно к полу-препаративной системы HPLC для очистки желаемого продукта.Для измерения квантовой эффективности под люминесцентными лампами, покрытыми ультрафиолетовым светом, отключают фильтр, разбавляют образец стокового раствора в 10 микролитров диметилового сульфоксида 10 миллилитров буфера KMOPS. Перенесите алицит раствора в ту же пробирку, используемую в фотореагентной реакции химического актинометра. Облучать образец раствора 350 нанометровым светом в течение пяти секунд, периодически удаляя 50 микролитровых алицитов из облученные растворы для анализа HPLC.Затем определите время облучения в секундах, в которых 90% исходного материала реагировали на установку участков времени зависимого исчезновения исходного материала. Для HaloTag лиганд ориентации интерактивных клетке соединения, урожай целевой группы населения интерес с соответствующим реагентом диссоциации клеток и повторно приостановить клетки в 2,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации DMEM. Затем семена примерно от 10 до пятой клетки на блюдо в 35 миллилитров стекла нижней блюда для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.На следующее утро разбавляют 14 микрограммов ДНК ПК тремя гало эпидермальным фактором роста рецептора плазменной ДНК в 1,5 миллилитровой микро центрифуге трубки, содержащей 700 микролитров уменьшенной среды сыворотки. Затем добавьте пять микролитров реагента липофекции в 150 микролитров пониженной среды сыворотки к каждой из четырех трубок и позвольте трубам стоять при температуре окружающей среды в течение пяти минут. В конце инкубации добавьте 150 микролитров разбавленной плазменной ДНК к каждому из разбавленных образцов реагентов липофека и инкубировать образцы при температуре окружающей среды еще пять минут.В конце инкубации, промыть клетки с двумя миллилитров PBS на блюдо и добавить 1,5 миллилитров уменьшенной среде сыворотки к каждой культуре. Добавьте к каждому блюду 150 микролитров плазмидного реагентного комплекса липофекции и верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов. В конце инкубации, аспирировать supernatants и добавить один миллилитр свежеприготовленных DMEM дополнены двумя микромолярной paBhc hex fitzi гало к каждому блюду.После 30 минут при 37 градусах по Цельсию, аспирировать среды, содержащей в клетке соединения и промыть клетки два раза с одним миллилитром PBS плюс удалить любые несырья соединений. Добавьте 500 микролитров уменьшенной среды сыворотки к каждому блюду и верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 30 минут, чтобы удалить соединения, которые вошли в клетки. В конце инкубации, промыть клетки два раза с одним миллилитрОМ PBS плюс на блюдо и добавить один миллилитр среды без фенола красный к каждой культуре.Затем записывают изображения флуоресценции с помощью лазерного сканирования микроскопии конфокального флорескции. Для фото-опосредованой модуляции локализации киназы с помощью щелкаемого соединения в клетке, семя примерно пять раз от 10 до пятого TOC-A-one клеток в двух миллилитров F12 среды ветчины на 35 миллилитров стекла нижней блюдо. На следующий день, трансфект клеток с плазмидным кодированием для GFP diacylglycerol киназы гамма в течение 48 часов, как только что продемонстрировали.После окончания трансфекции замените супернатант трансфекции двумя миллилитров пониженной среды сыворотки. Добавить 20 микролитров 100 раз paBhcAA рабочий раствор для клеток в течение пяти до 60 минут инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. В конце инкубации поместите блюдо на объективную стадию перевернутого флуоресцентного микроскопа, оснащенного двойным световым источником флуоресцентного осветителя.Изображение клеток каждые 10 секунд в течение 10 минут при облучении клеток в соответствующих экспериментальных точек времени и длины волн в соответствии с экспериментальным протоколом. Используя этот метод, как попродемонстрировано, интерактивные клетки соединений некоторых биологически интересных молекул, в том числе паклитаксель и арахидоновая кислота, могут быть успешно синтезированы. Дополнительные свойства, такие как водонепроницаемость воды и способность клеточного таргетинга могут быть введены в paBhc макет paclitaxel через медь один катализированную реакцию клика циклизации.Эти интерактивные клетки paclitaxels затем могут быть фотолайсированы для производства своих родительских соединений при облучению на 350 нанометров. Физические и фотохимические свойства интерактивных клетчатых соединений суммируются в таблице. В живых клеточных экспериментов, ориентации paBhc hex fitzi гало культурных клеток млекопитающих преходяще выражая HaloTagged белка и эпидермального фактора роста рецептор вызывает зеленый сигнал флорескции от флуоресцентного moiety PAHBHC hex fitzi гало на клеточной мембране.Кроме того, лечение клеток CHO-K1, преходяще выражаюх GFP diacyl glycerol kinase гамма с арахидоновой кислотой, вызывает модуляцию субклеточной локализации диазилгликола киназы гамма. Аналогичные изменения в диакилглицерол киназы гамма-локализации также наблюдаются в paBhc-AA обработанных клеток после воздействия УФ-излучения. При выполнении экспериментов caging в aqueous решений увеличения культуры среды, не забудьте всегда работать под флуоресцентной лампы с короткой длины волны ограничен фильтр.После этой процедуры, вы можете изучить клетке соединений, которые были в изобилии для использования в биологических экспериментах из-за отсутствия воды solubility, мембраны проницаемости или клеточной ориентации способности.

design-synthesis-photochemical-properties-clickable-caged

Research

JoVE Journal

Chemistry

Химия

Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо...

Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите

Мы генетически кодирования искусственную аминокислоту, р-азидо-L-фенилаланина в различных целевых позиций в GPCRs и показать универсальность азидогруппы в различных приложениях. Они включают в себя целевой фотосшивки технологии для выявления остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR и по конкретным участкам bioorthogonal модификацию GPCRs с пептид-эпитопной меткой или флуоресцентного зонда.

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

Молекулы органических красителей и наночастицы, покрытые олеиновой кислотой, не растворяются в воде. Этот протокол описывает метод «plug and play», который позволяет переносить молекулы органических красителей и повышающие конверсию частиц из их исходного гидрофобного растворителя в воду.

Метод «подключи и работай», чтобы создать воду диспергируемые Nanoassemblies Содержит амфифильным полимер, органических красителей и преобразования вверх наночастиц

Фотостабильные цианиновые красители присоединяются к олигонуклеотидам для мониторинга гибридизации путем передачи энергии.

Синтез Длина волны сдвига ДНК гибридизационных зондов с помощью фотостабильным цианиновыми Красители

Этот протокол подробно описываются важные шаги, необходимые для биоконъюгации цистеина, содержащего белок малеимид, в том числе очистки реагентов, условий реакции, очистки Bioconjugate и Bioconjugate характеристики.

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

Мы описываем здесь метод идентификации малых молекул-связывающих белков с помощью мечения фотоаффинностью. Преимущество этого метода заключается в том, что связывание и ковалентное мечение белков-мишеней происходит в живой клеточной среде, устраняя риск нарушения структуры нативного белка и условий связывания при лизисе клеток.

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Здесь мы представляем протокол для сайт-специфического введения химических зондов во фрагмент антитела путем генетического включения аминокислоты, содержащей азид, и последующего связывания азида с химическим зондом с помощью стимулируемого штаммом азид-алкинового циклоприсоединения (SPAAC).

Эффективная и сайта специфических антител к Этикетировочное штаммом раскрученной азида-алкиновая циклоприсоединения

В этом протоколе, клетке протеинкиназа A (PKA), bioeffector трансдукции сигнала сотовой, иммобилизованных на поверхности наночастиц, microinjected в цитозоль и активированную upconverted УФ света от ближней ИК-области спектра (NIR) облучения, вызывая вниз по течению стресс волокна дезинтеграции в цитозоль.

Комплексная система удаленно вызвать внутриклеточного сигнала по Upconversion наночастиц-опосредованной киназы Photoactivation

Легковесные флуоресценции пробирного представлен для оценки эффективности амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар включению белков в клетках млекопитающих неканонических амино кислот (ncAAs). Описывается применение ncAAs учиться G-протеин рецепторов (GPCR), включая фото сшивки отображение привязки сайтов и bioorthogonal GPCR маркировки на живые клетки.

Оптимизации генетическим включение химического зондов в GPCR для фото сшивки картирования и Bioorthogonal химии в живых клетках млекопитающих

Этот протокол описывает свет срабатывает ядерной транслокации гостей в живых клеток с помощью тегов клетке молекулярный клей. Этот метод является перспективным для сайта селективные таргетинг доставки лекарств.

Spatiotemporally контролируемых ядерных транслокации гостей в живых клеток с помощью клетке молекулярный клей как Photoactivatable Теги

Изучите синтез модульных фотоклеточных соединений с кликабельными группами для нейронауки. Этот метод позволяет добавить водорастворимость и клеточное таргетирование без потери фоточувствительности.

Дизайн, синтез и фотохимические свойства clickable Caged соединений

Больше видео