Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов
30 июля 2019 г.
Насосы Xenobiotic efflux очень активны в гематопоитических стволовых и прародителей (HSPCs) и вызывают экструзию TMRM, митохондриальной мембраны потенциал флуоресцентного красителя. Здесь мы представляем протокол для точного измерения митохондриального мембранного потенциала в HSPCs TMRM в присутствии Verapamil, ингибитор насоса efflux.
Митохондриальная функция имеет решающее значение для гематопоэтического обновления стволовых клеток. Митохондриальная активность является отражателем внутреннего митохондриального мембранного потенциала, который может быть измерен TMRM, клеточным флуоресцентным, клеточным катионическим красителем. Ксенобиотические насосы эффлюкса очень активны в HSC, и вызывают экструзию TMRM.
Основным преимуществом этого протокола является коррекция этого эффекта, используя Verapamil, ингибитор насосов эффлюкса. Начните с изоляции костного мозга от бедренной кости мыши. Используйте пару типсов и острые ножницы, чтобы сократить две задние лапы.
Затем сделайте небольшой фрагмент в брюшной коже мыши, и растянуть его. Извлекайте бедренную кость и голени, при этом заботясь, чтобы не выбить головы бедренной кости, и поместите кости в шести-хорошо пластины, наполненные 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Удалить мышцы из костей, и сократить концы костей, что позволяет костного мозга, чтобы выйти.
Поместите очищенные кости в новые колодцы, с 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Затем вымоййте костный мозг с помощью трехмилилитрового шприца и иглы 25 калибра, пока кость не станет белой. Соберите все клетки в 1,5 миллилитровую трубку, и центрифуга их в течение пяти минут при 180 раз G, а затем отказаться от супернатанта.
Тщательно повторно помесить гранулы в 300 микролитров ледяной ACK лизай буфера, и положить клетки на лед в течение одной минуты. Затем немедленно деактивировать лиз, добавив один миллилитр окрашивания буфера. Центрифуга клеток в течение пяти минут в 180 раз G.Resuspend ячейки гранулы, которые должны появиться белые, в один миллилитр окрашивания буфера.
Фильтр клетки с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы получить моноядерные клетки. Начните с подготовки линии коктейль, и флюорофор конъюгированных антител, в соответствии с рукописными указаниями. Держите антитела на льду, и защищены от света.
Затем центрифуга образец в течение пяти минут при 180 раз G, и отказаться от супернатанта. Добавьте 400 микролитров коктейля линии и четыре микролитера биотинилированных антител CD135 в клеточные гранулы и вихревые смеси. Затем инкубировать его на льду в течение 30 минут.
После инкубации, мыть образец, добавив три миллилитров окрашивания буфера, спиннинг его вниз в течение пяти минут при 180 раз G, и отбрасывая супернатант. Затем добавьте 400 микролитров раствора антител и вихрем смеси. Инкубировать его на льду еще 30 минут, и повторить мыть с окрашивания буфера.
Для приготовления раствора окрашивания ТМРМ добавьте 2,2 микролитера раствора TMRM и 1,1 микролитров Verapamil к 1,1 миллилитров безотхвисточной гематопоэтической культуры среднего, с тромбопоэтиным и стволовым клеточным фактором. Переподходить костный мозг в один миллилитр раствора окрашивания TMRM, вихрь быстро, и инкубировать в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию. Фильтр образца с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы избежать засорения цитометра потока.
Затем добавьте один микролитер DAPI и приступайте к цитометрии потока. Вы запустите образец костного мозга, и приобрести по крайней мере один миллион событий. Затем отобразите живые моноядерные клетки костного мозга в участке для тихоокеанского синего цвета, чтобы определить CD135 Lin-отрицательные и лин-положительные фракции.
Участок Lin-отрицательная фракция для APC/Cy7 против PE/Cy7 для определения мультипотентного прародителя или фракции MPP. Затем вырисуй фракцию MPP для APC против PerCP/Cy5.5, чтобы определить гематопоэтическую стволовую клетку или фракцию HSC. Отображение фракции HSC для FITC, или CD34, чтобы разделить ее на CD34 отрицательных HSC и CD34 положительных фракций HSC.
Окончательно приобретайте интенсивность TMRM в каждой населенности. Чтобы Окрашивание ТМР работало правильно, добавьте в образец один микролитр FCCP для окончательной концентрации одного миллимолара и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем приобрети миллион событий.
После добавления FCCP интенсивность ТМРМ должна быть резко увеличена. Этот протокол был успешно использован для количественной оценки митохондриального мембранного потенциала в различных популяциях клеток, с красителем TMRM. Было продемонстрировано, что присутствие PBS и FBS в культурной среде влияет на интенсивность сигнала TMRM.
Поэтому важно выполнять Окрашивание TMRM в среде расширения без сыворотки. Гематопоэтические стволовые клетки выражают высокий уровень активности ксенобиотических насосов эффлюкса, которые выдавляют краситель TMRM. Профили TMRM также различаются в присутствии Verapamil или Cyclosporin H, которые блокируют насосы.
Чтобы проверить точность окрашивания TMRM, FCCP может быть деполяризировать митохондрии, и уменьшить интенсивность TMRM. Этот протокол может быть легко адаптирован для изучения HSC с различными митохондриальной мембраны потенциального красителя, в том числе TMRE или JC-1. А также другие митохондриальные красители, такие как MitoTracker или MitoSOX.
Критические вопросы, унаследованные различной активностью эффлюкс насосов среди популяции костного мозга было отмечено совсем недавно. Таким образом, этот протокол направлен на сокращение расхождения между предыдущими выводами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании с помощью флуоресцентного красителя TMRM изучается мембранный потенциал митохондрий в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках (HSPCs), а также влияние эффлюксных насосов ксенобиотиков. Представлен протокол с использованием Верапамила для точного измерения уровней TMRM путем ингибирования этих насосов, что позволяет достоверно оценить функцию митохондрий.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Митохондриальная динамика в стволовых клетках
- Механизмы клеточного эффлюкса
- Измерение мембранного потенциала
Теоретическая база
- Значение функции митохондрий в обновлении стволовых клеток
- Проблемы, создаваемые эффлюксными насосами при измерении содержания красителя
- Использование TMRM в качестве индикатора митохондриального потенциала
Используемые методы
- Выделение костного мозга мышей
- Проточная цитометрия для анализа клеточных популяций
- Ингибирование эффлюксных насосов с помощью Верапамила
Основные результаты
- Успешное количественное определение потенциала митохондриальной мембраны в HSPC
- Продемонстрированное влияние верапамила на удержание TMRM
- Возможность адаптации протокола для использования альтернативных митохондриальных красителей
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод оценки митохондриальной активности в стволовых клетках.
- Полученные результаты расширяют понимание биологии стволовых клеток и влияния фармакологических агентов на функцию митохондрий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная оценка митохондриального мембранного потенциала в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках имеет важное значение для понимания процессов самообновления и метаболической регуляции стволовых клеток. Активность эффлюксных насосов в этих клетках может искажать результаты измерений с использованием флуоресцентных красителей, что приводит к систематическим ошибкам в данных, влияющим на валидацию мишеней и надежность доклинических моделей. Данный протокол устраняет ключевое техническое ограничение анализов на основе проточной цитометрии, повышая согласованность данных для последующих поисковых и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать митохондриальную функцию как терапевтическую мишень в гемопоэтических стволовых клетках за счет снижения артефактов измерения, вызванных выходом красителя из клеток.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность согласованного сравнения популяций стволовых клеток и клеток-предшественников в различных экспериментальных моделях путем коррекции вариабельности ксенобиотических транспортеров.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных гемопоэтических систем для скрининга соединений путем обеспечения того, чтобы показатели митохондриального потенциала отражали истинное биологическое состояние, а не активность эффлюкса.
- Практическая ценность: Повышение воспроизводимости и стандартизации анализа за счет использования ингибиторов эффлюксных насосов, таких как Verapamil, в протоколах окрашивания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков, предоставляя достоверные данные о митохондриальной активности, связанной с путями самообновления стволовых клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет стандартизации ключевого функционального показателя в различных модельных системах.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум научных открытий, обеспечивая проверку гипотез в биологии стволовых клеток и позволяя проводить надежное функциональное профилирование перед этапом поиска перспективных соединений.
- Поисковая биология: способствует валидации митохондриальных мишеней и уточнению путей в гемопоэтических системах за счет минимизации ложнозаниженных сигналов, вызванных экструзией красителя.
- Скрининг: обеспечивает количественные и воспроизводимые измерения митохондриального потенциала при ингибировании эффлюкса, что улучшает обнаружение эффекта соединений.
- Аналитика: позволяет получать данные на основе проточной цитометрии (интенсивность TMRM) для сравнения метаболических состояний различных клеточных фракций и условий обработки.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклиническими работами, предоставляя переносимый показатель жизнеспособности стволовых клеток, который коррелирует с функциональными исходами.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает многократно используемый рабочий процесс проточной цитометрии для оценки состояния митохондрий в моделях стволовых клеток в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в исследованиях механизмов работы стволовых клеток за счет устранения основного источника вариабельности анализа.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость анализов митохондрий в условиях исследований гемопоэза.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованное принятие решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) при валидации мишеней за счет снижения количества ложноотрицательных результатов, связанных с эффлюксом красителя.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней стволовых клеток с учетом рисков на основе более точных функциональных данных.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области проточной цитометрии, выделения стволовых клеток и работы с флуоресцентными красителями.
- Зависимость от наличия верапамила или альтернативных ингибиторов эффлюксных насосов, а также совместимых буферов для окрашивания.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия времени воздействия и концентрации ингибитора.
- Необходимо учитывать возможные побочные эффекты верапамила на жизнеспособность или метаболизм клеток в долгосрочных культурах.
- Применимо только в тех случаях, когда потенциал митохондриальной мембраны является релевантным функциональным показателем, а активность эффлюкса оказывает известное влияние.
