Механистический Взгляд на развитие TNBS-опосредованного кишечного фиброза и оценки ингибиторных эффектов рапамицина

Этот протокол демонстрирует весьма сопоставимые патофизиологии фиброза Крона в организме человека, а также обсуждает рапамицин-опосредованное ингибирующее воздействие на кишечный фиброз. Основным преимуществом этого протокола является то, что он описывает развитие кишечного фиброза в очень короткий промежуток времени, варьируемый от четырех до восьми недель, что дает нам возможность изучить восстановление тканей и регенерацию тканей. Этот протокол будет полезным для исследователей, которые находятся в спешке, чтобы получить механизм фиброза, и помочь найти лучшую технологию для прогнозирования вмешательства для Крона связанных кишечного фиброза.

Чтобы начать эту процедуру, брить взрослых мышей вокруг области шеи для того, чтобы предварительно сенсибилизировать их TNBS через дермальное воздействие. Затем замочите тампон coton с TNBS и применить его к бритой области шеи мыши. Восемь дней после сенсибилизации, вызывают колит интраректальной администрации один раз в неделю, в течение шести недель.

Для этого нанесите четыре миллиграмма TNBS на 25% этанола с помощью 100 микролитровой клизмы через одноми миллилитровый шприц, прикрепленный к стальной игле. Дайте контроль мышам 100 микролитров только 25% этанола. После анестезии мышей, intraperitoneally вводить либо рапамицин на два миллиграмма на килограмм в день, или транспортного средства, или оба, каждый будний день в течение трех-шести недель, как контроль и TNBS-обработанных мышей.

После этого используйте шестинедельный кишечник TNBS после лечения мышей для анализа внеклеточных анализов. Во-первых, открыть толстой кишки продольно в ледяной HBSS и мыть толстой кишки в HBSS. Используя стерильные ножницы, разрежьте толстую кишку на мелкие кусочки, которые примерно пять сантиметров в HBSS.

Перенесите мелкие кусочки толстой кишки в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую 10 миллилитров до переваривания буфера. Встряхните трубку при 100 об/мин в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем пройдите суспензию через 40-метровый клеточный ситечко и отбросьте прикрепленный эпителий толстой кишки.

Соберите оставшиеся ткани из ситечко и усваиваете их дальше в буфере пищеварения, содержащем коллагеназу типа IV и DNASE1 в 1X HBSS с 5%FBS в течение 20 минут в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию при встряхивании при 100 об/мин. После этого, вихрь переваренных тканей в течение примерно 20 секунд и передать его через 40 микрометровых клеток ситечко для получения ламина проприа фракций. Центрифуга ламина проприа фракций в 700 раз G и четыре градуса по Цельсию, чтобы гранулы вниз клеток.

Затем сделайте 100 миллилитров как 30%, так и 70%density градиентных медиа-решений. Resuspend полученных клеток в 10 миллилитров 30%-раствора и наложить это на вершине пять миллилитров 70%-раствора в 15 миллилитров трубки. Центрифуга градиента в свободном состоянии при температуре 1000 Г и комнатной температуре.

Соберите фазу белого кольца, содержащую лимфоциты ламина проприа, которые будут между 30%и 70%-градиентными слоями. Вымойте полученные клетки путем повторного перерасхода их в ледяной HBSS и центрифугирования в 500 раз G и 10 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем повторное приостановление ячеек в буфере FACS.

Перед окрашиванием антител сначала блокируйте поверхность клеток ламины проприии, инкубируя их антимошейным CD16 блокатором 32FC на льду в течение 15 минут. Далее инкубировать клетки с анти-CX3CR1 PE антител вместе с анти-PE микробусы на льду в течение 30 минут, чтобы захватить связанные клетки, а затем мыть клетки с буфером FACS. Перейдите антитела и бисером связанных клеток через магнитной активированной ячейки сортировки колонки в магнитном поле, чтобы удалить неограниченные клетки.

Вымойте ячейки три раза с буфером FACS. После этого снимите столбец с магнитного поля и нажмите поршень в столбце, чтобы дать бисером связанных клеток. Во-первых, блокировать клетки ламина проприии с анти-мышь CD16 на 32FC блокатор на льду.

Процедить клетки путем инкубации с анти-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C и MHC класса II антител Затем сортировать клетки с помощью цитометра потока FACS, как указано в текстовом протоколе. Выразите отсортированные клетки для полного приготовления РНК и обнаружите цитокины и фиброзные маркеры. Проанализируйте экспрессию мРНК фиброзных маркеров и воспалительный анализ цитокинов из изолированных одноклеточных суспензий от магнитной очистки.

Для начала окрашивания и анализа поверхности клеток, повторное строительство от 500 000 до 1 миллиона изолированных клеток ламины проприи в 15 миллилитров буфера FACS. Инкубировать клетки анти-CD16 на 32 антитела при разбавлении от 1 до 50 на льду в течение 10 минут. После этого, мыть клетки с 500 микролитров ледяного буфера FACS для удаления несыхваных антител.

Поверхностное пятно толстой кишки одноклеточных суспензий с флуоресцентными помеченными антителами при разбавлении от 1 до 100 на льду в течение 30 минут. Вымойте помеченные клетки дважды, чтобы удалить неограниченные антитела, используя 500 микролитров ледяного буфера FACS для каждой стирки. Затем проанализируйте помеченные моноядерные клетки по цитометру потока, как указано в текстовом протоколе.

Для начала внутриклеточного окрашивания и анализа цитокинов и анализа используйте набор растворов для фиксации и проницаемой поверхности клеток в соответствии с инструкциями производителя. Ворота ламина проприи клетки, изложенные в текстовом протоколе для обнаружения внутриклеточного уровня IL-1 бета цитокинов. Затем промойте ячейки, добавив буфер FACS и центрифугирование в 200 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, чтобы удалить избыточный фиксатор буфера.

Повторите эту стирку один раз. Чтобы определить уровень альфа-гладкой мышцы актина, сначала пронизывают клетки с набором раствора протеабилизации фиксации. Инкубировать клетки с анти-альфа SMA Alexa Fluor 488 антител при разбавлении от 1 до 1000 на льду в течение 30 минут.

Затем промыть клетки, добавив буфер FACS и центрифугирования в 200 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, чтобы удалить избыток фиксатор буфера. Повторите эту стирку один раз. Выполните анализ FACS и ворота ячеек, как указано в текстовом протоколе.

В этом исследовании TNBS колит мыши модель принята для изучения и выяснения основных механизмов кишечного фиброза. После шести недель лечения TNBS, видно, что длина толстой кишки постепенно сокращается в течение лечения TNBS примерно с пяти сантиметров в контрольной группе примерно до трех сантиметров в группе TNBS. Для того, чтобы модель болезни ТНБС Крона была сопоставима с моделью фиброза человека Крона и не является артефактом, связанным с методологией, фиброзные маркеры анализируются на нескольких уровнях в подробном исследовании времени.

Накопление альфа-гладких мышц актин положительных клеток и осаждения коллагена в субмукозальных слоев были зарегистрированы в большинстве случаев фиброза и рассматривается как отличительная черта для фиброзных событий Для сравнения фиброза TNBS с кроны связанных фиброз, выражение фиброзных маркеров и цитокинов анализируется в биопсии свежих тканей от илеума пациентов с активной CD или под ремиссией. Примечательно, что наблюдается отмеченная индукция утолщения альфа-гладких мышечных актиновых положительных слоев и увеличение осаждения коллагена в активных секциях компакт-дисков. Западный анализ помарки выполнен для того чтобы подтвердить индукцию альфа-гладкого выражения актина мышцы в активных образцах CD.

Кроме того, значительные индукции фиброзных маркеров обнаруживается с помощью анализа qPCR. Затем оцениваются эффекты рапамицина, фармакологического ингибитора активности М4, чтобы определить механизм ограничения фиброза ТНБС. Мышей лечат как TNBS и рапамицин и уровни альфа гладкой мышечной актина и коллагена в гистологии толстой кишки анализируются.

Важно помнить, чтобы привить одинаковое количество TNBS к каждой мыши и обрабатывать изолированные клетки ламины проприии как можно скорее, чтобы избежать потери клеток, а также для поддержания жизнеспособности клеток. В нашем протоколе подробно говорится о фиброзе ТНБС и ремиссии фиброза, а также о ингибирующем факторе рапамицина при формировании фиброза. Другие исследователи могут быть заинтересованы в использовании этого метода, чтобы найти лучшую цель наркотиков для фиброза и рака толстой кишки.

Пожалуйста, помните, что TNBS является раздражающим кожи и лабораторные пальто следует носить во время обработки, чтобы избежать контакта с кожей.