Изоляция intact глазного яблока для получения интегральной глазной поверхностной ткани для гистологического обследования и иммуногистохимии
20 октября 2019 г.
Этот протокол описывает метод изоляции глазного яблока мыши с веком, глазной поверхностью, передней и задней сегментами в относительно неповрежденном положении.
Наша лаборатория фокусируется на развитии глаз и заболеваний. Этот протокол описывает метод для удаления черепа и орбитальных костей последовательно из расчлененной головы мыши. Оставляя веки, глазную поверхность, хрусталик и сетчатку все вместе в один кусок. Протокол пойдет на пользу офтальмологам, которые интересуются окулярной поверхностной дидактикой. Я Dianlel Го, чтобы сказать технику с вероятной борьбы при попытке избежать повреждения глазного яблока, в то время как вскрытие лицевых костей. Основным преимуществом этого вскрытия является то, что целостность эпителиального листа глазной поверхности хорошо сохранилась и различные части глазной поверхности могут быть изучены гистологией или иммуностелением в одном разделе. Обязательно отрежьте все мелкие кости и обломки мягких тканей. Причина, это вызовет шрамы на участке ткани в противном случае. После усыпать мышь, используйте пару прямых ножниц, чтобы отрезать голову и разрезать ее вдоль sagittal средней линии, начиная с внутрипариетальной кости ростральной к носу. Поместите каждую половину разделенной головы в чистую чашку Петри и используйте острые ножницы, чтобы отрезать челюсть и язык. Освободите зрительный нерв, отрезав его от мозга до расположения оптического чиазма. И удалить все ткани мозга, включая обонятельную лампу, которая крепится к стене черепа. Теперь все остальные ткани должны иметь все черепа и орбитальные кости, связанные с глазным яблоком. Вымойте оставшиеся части с PBS, чтобы очистить от любой крови и волос мусора. Предварительно исправить ткани, поместив их в 50 миллилитров трубки, содержащей 4%paraformaldehyde и вращая их при комнатной температуре. После того, как приставка завершена, быстро мыть вскрытую голову в PBS три раза, чтобы еще больше устранить сломанные волосы и фиксаторы. Поместите ткань в 10-сантиметровую чашку Петри и разрежьте череп на три части вдоль плоскостей, указанных на рисунке одного из текстового протокола. Глазное яблоко и розетка скрыты в средней части черепа под этмоидными, лобными и челюстно-челюстными костями. Используйте две пары прямых типсов номер четыре, чтобы снять этмоидную кость и полностью разоблачить лобные и челюстные кости. Затем географически разделите поверхность черепа на четыре области. Вставьте кончик изогнутых типсов горизонтально в каждую область, чтобы удалить челюстно-лобные кости последовательно. После этого будут выставлены лежащие в основе лакримальные и джугальовые кости. Удалите две кости и связанные с ними подкожные мышцы и жиры, окружающие глазное яблоко. Обрезать глазное яблоко с прикрепленными веками и кожей в небольшой, квадратной формы блока для уменьшения объема тканей и облегчения ориентации ткани при встраивании. Поместите глазное яблоко и связанные с ним ткани обратно в 4%paraformaldehyde и продолжать чинить на ночь в 4
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол посвящен методу выделения глазного яблока мыши с сохранением веко и поверхности глаза в целости, что позволяет сберечь анатомическое строение для проведения анатомических исследований. Эта методика особенно полезна для офтальмологов, стремящихся изучить поверхности глаза, не повреждая при этом чувствительные ткани.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Развитие органов зрения
- Заболевания глаз
- Гистология и иммуноокрашивание
Теоретические основы
- Важность сохранения целостности поверхности глаза
- Сложности препарирования глазных яблок мыши без повреждений
- Применение в офтальмологическом образовании
Используемые методы
- Последовательное удаление костей черепа и глазниц
- Модель на мышах
- Использование параформальдегида для фиксации тканей
Основные результаты
- Данный протокол позволяет сохранить эпителиальный пласт поверхности глаза для последующего исследования
- Обеспечивает возможность проведения гистологического анализа или иммуногистохимического окрашивания
- Демонстрирует эффективные методы диссекции органов зрения
Выводы
- В исследовании представлен надежный метод выделения глазного яблока мыши с прилегающими структурами
- Имеет важное значение для исследований, связанных со здоровьем и заболеваниями глаз
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Сохранение целостности эпителиального слоя поверхности глаза позволяет проводить параллельную оценку конъюнктивы век, конъюнктивы глазного яблока и эпителия роговицы в моделях заболеваний. Данный подход способствует снижению механистических рисков, позволяя одновременно оценивать патогенетические изменения в相互связанных тканях. Это повышает прогностическую достоверность доклинических исследований, требующих сохранения структуры ткани для гистологического анализа и иммуноокрашивания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет сохранения пространственных взаимосвязей внутри эпителиального пласта поверхности глаза.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков благодаря подготовке целостной ткани для параллельного гистологического анализа патологических изменений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет подготавливать валидированные биологические системы с сохраненной архитектурой поверхности глаза для последующего иммуноокрашивания и гистологического анализа.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа за счет минимизации деформации тканей при диссекции, что повышает воспроизводимость результатов между срезами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет целостность системы, релевантной патологии, что позволяет согласовывать трансляционные биомаркеры в различных взаимосвязанных областях поверхности глаза.
- Практическая ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет сохранения морфологии тканей для единообразного серирования и анализа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы по поисковой биологии, обеспечивая подготовку целостных тканей для гистологического анализа и иммуноокрашивания, что позволяет проверить гипотезы и уточнить сигнальные пути.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез за счет сохранения целостности эпителиального пласта для параллельного исследования конъюнктивальных и роговичных областей.
- Скрининг: повышает готовность анализа за счет воспроизводимой изоляции тканей, что снижает вариабельность при гистологическом секционировании.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных с помощью иммуноокрашивания и гистологии на целых срезах тканей.
- Трансляционные исследования: связывают фундаментальные открытия с доклиническим этапом за счет сохранения архитектуры поверхности глаза для согласованной патологической оценки.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую методику подготовки поверхности глаза для использования в различных моделях заболеваний и кампаниях по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов за счет сохранения архитектуры тканей, что позволяет проводить одновременный анализ нескольких отделов поверхности глаза.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря единому протоколу препарирования, который сводит к минимуму повреждение тканей и возникновение артефактов при нарезке.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет устранения механистической неопределенности в моделях заболеваний глаз посредством оценки целостных тканей.
- Влияние на портфель проектов: Приоритизация с учетом рисков, ставшая возможной благодаря надежным данным гистологического анализа и иммуноокрашивания препаратов целостной поверхности глаза.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах микрохирургического препарирования, чтобы избежать повреждения тканей при удалении кости.
- Необходимость использования острых ножниц и тонкого пинцета для точного отделения костей черепа и орбитальных костей от мягких тканей.
- Необходимость использования стандартизированных протоколов фиксации с применением параформальдегида для сохранения целостности тканей при нарезке срезов.
- Требуется учет особенностей адаптации метода при применении к различным модельным системам или стадиям развития.
- Практическое ограничение: эффективность процедуры зависит от полного удаления костных остатков для предотвращения появления артефактов при нарезке срезов.
