Производство E.coli-выраженные самосборки белковых наночастиц для вакцин, требующих тримерной эпитопной презентации
21 августа 2019 г.
Здесь приводится подробный метод, описывающий очистку, сворачивание и характеристику самосборки белковых наночастиц (SAPN) для использования в разработке вакцины.
Самосборка белковых наночастиц, или SAPNs, может быть использована для разработки вакцин против различных инфекционных заболеваний. Этот метод, который мы описываем здесь, может быть использован для очистки, повторного использования и характеристики SAPNs, содержащих шести-спиральный пучок. Эта наночастица может представлять тримерные антигены в родной конформации.
При небольших изменениях этот метод может быть применен к другим инновационным конструкциям вакцины SAPN. Кроме того, он может быть легко переносим на крупномасштабное производство для клинических испытаний. Для лиза собранного E.coli, выражаюго шести-спиральный пучок SAPN, используйте зонд с выходом звуковой связи 150 Вт с четырьмя секундами звуковой связи и шестью секундами отдыха, чтобы соникатировать перерасход бактериальных гранул в 40 миллилитров буфера без имидазола на льду в течение пяти минут.
Центрифуга клеточного лизата для создания очищенного супернатанта и переноса супернатанта в стерильную 150-миллилитровую колбу. Затем довнесите образец до конечного объема в 100 миллилитров со свежим буфером без имидазола. Чтобы изолировать белок интереса, откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на опцию New Method.
В меню «Настройки метода» откройте меню высадки столбца и выберите порт C1 3. В меню высадки по технике выберите Affinity. В меню высадки типов столбцев выберите Другие, HisTrap HP и пять миллилитров.
Объем столбца и коробки давления будут автоматически установлены к соответствующим значениям. Нажмите Нарисуйте описание метода и перетащите кнопки Equilibration и Sample Application, три кнопки Column Wash и кнопку Elution из всплывающего меню Phase Library рядом со стрелкой перед закрытием меню Phase Library. Нажмите Equilibration и установите значения, перечисленные в таблице для первоначального буфера B, 4%Final Buffer B, 4%и Объем столбца, пять.
Нажмите Пример приложения. В коробке загрузки образца нажмите кнопку радиоприемка для инъекционного образца на колонке с помощью образца насоса и подтвердите, что коробка рядом с скоростью потока использования из настроек метода проверяется в коробке образца с системной насосной коробкой. Измените значение коробки Volume до 100 миллилитров и схему сбора фракций для включения.
Отликуй размер фракции использования из коробки настроек метода и измените размер фракции на четыре миллилитра. Нажмите на первую кнопку Column Wash, установите значения, перечисленные в таблице, на initial Buffer B, 4%Final Buffer B, 4%и Column Volume, 10. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.
Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на вторую кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, пять. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.
Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на третью кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, 10. Нажмите кнопку Схема сбора фракций Включить и отмять размер фракции использования из коробки настроек метода.
Затем измените размер фракции на четыре миллилитров. Нажмите кнопку Elution и нажмите правой кнопкой мыши на информацию в таблице. В всплывающем меню щелкните Удалите шаг и перетащите кнопку градиента isocratic на стол два раза, так что есть две записи.
Установите значение для первой записи в Initial Buffer B, 30%Final Buffer B, 30%и Объем колонны, 10. Установите значение для второй записи в Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100%и Объем колонны, 10. Нажмите кнопку «Схема сбора фракций» и нажмите кнопку «Размер фракции использования» из коробки настроек метода.
Затем щелкните Save As и назовите очистку файла. Поместите насос трубки FPLC в буфер мытья без имидазола, и насос B трубки в 500-миллимоляйный буфер имидазола. Поместите образец насоса трубки в 100-миллилитровый образец и запустить программу очистки.
Когда 60%isopropanol мыть необходимо, приостановить программу, переместить насос трубки из имидазола свободной мыть в 60%isopropanol мыть, и перезапустить программу. В конце стирки, приостановить программу еще раз, вернуть насос трубки имидазола свободной мыть буфера, и перезапустить программу очистки. Чтобы оценить чистоту очищенного белка, сначала объединить фракции из потока через, мыть один, мыть два, и мыть три шага, в отдельных 50-миллилитровых конических труб.
Затем смешайте 15 микролитров из каждой пробной трубки с 15 микролитров буфера 2X Laemmli в отдельных 0,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках и денатурировать образцы при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. В конце инкубации, создать гель работает аппарат с тремя пятно-бесплатно четыре до 20%precast полиакриламинид гели в Tris-Глицин SDS-PAGE работает буфер. Загрузите восемь микролитров молекулярного маркера веса к первой скважине каждого геля и 30 микролитров денатурированного образца к другим скважинам.
Запустите гели на 200 вольт, пока краситель фронт хитов нижней части геля и кратко промыть гели с деионизированной водой, прежде чем сразу же изображения с пятном свободной системы изображений. Затем определите фракции, содержащие белковые полосы с правильным размером, и объединить эти фракции. Для шести-спиральный пучок SAPN повторного сфасинга, добавить от 10 до 20 миллилитров слитка белка в 10 килодальтон молекулярного веса отрезаны диализа кассеты.
Диализуйте кассету в восьми молярных мочевинах, 20-миллимолярной трисе, 5%глицероле и пятимимолярной TCEP при комнатной температуре за одну ночь. На следующее утро, уменьшить концентрацию мочевины в буфере диализа stepwise на два моляра каждые два часа, чтобы медленно диализуют мочевину от образца. Когда концентрация мочевины достигнет двух моляров, перемести диализный аппарат до четырех градусов по Цельсию и облизав образец на 120-миллимолярдную мочевину, 20-миллимолярдные три и 5%глицерол на ночь, чтобы закончить развал.
На следующее утро снимите с кассеты слитый белок и отфильтруйте шестислойный пучок SAPN через 0,22-микрометровый фильтр фторида поливинилидена. Чтобы измерить средний размер частиц шестиполетного пучка SAPN, добавьте 45 микролитров шестиполетного пучка SAPN в одноразовый кювет и поместите кюветт в машину DLS. Затем создайте новый файл измерения и запустите заранее написанную стандартную операционную процедуру для белка в 120-миллимоляре мочевины, 20-миллимолярдных три и 5%глицерол буфера при 25 градусах по Цельсию.
Затем начните измерение. Для каждого запуска будет рассчитан средний размер, PDI и результаты распределения. Машина будет читать образец пять раз.
Этот полностью собранный шестислойный пучок SAPN построен на белковых последовательностях, которые, по прогнозам, складываются в частицу, которая содержит 60 копий мономера. Общий лизат клеток был использован для очистки шести-спирали расслоение SAPN мономеров FPLC с помощью колонки никеля, демонстрируя, что белок eluted на обоих 150 и 500-миллимолярновый имидазол. Хроматограмма также показывает два других пика на 185 и 210 миллилитров общего объема, соответствующего изопропанол мыть и имидазол-бесплатно мыть соответственно.
Фракции и чистота рекомбинантного белка могут быть определены градиентом SDS-PAGE гелей с белком интереса в основном расположены в фракции 68 до 79. Западный анализ помарки с антителами anti-His и anti-167D4 показал что соединенные фракции были деиствительно протеином интереса. Помарки также продемонстрировали наличие шести-спирали расслоение SAPN мультимеров.
Образцы, содержащие представляющие интерес, были сложены в полностью собранный шестислойный пучок SAPN путем диализа, а распределение размера частиц определялось анализом DLS и наночастиц. Визуализация с помощью электронной микроскопии передачи выявила хорошо сформироваваемые отдельные шестиу спирали пучка частиц SAPN с распределением размера, полученного из двух методов размера частиц. Наиболее важным шагом в этом протоколе является повторное сфасинг шести-спирали расслоение SAPN.
Правильный рН и ионическая прочность буфера рефолсирования имеют важное значение. Используя изопропанол мыть во время очистки, мы смогли уменьшить загрязняющих LPS до очень низкого уровня. Тем не менее, LPS может быть уменьшена с помощью столбца обмена аниона по мере необходимости.
Эта технология может быть легко адаптирована для применения человеком. Бактериальная выраженная SAPN уже была расширена для предстоящей фазы 1/2a клинических испытаний малярии.
Обзор
В данной статье описан метод очистки, рефолдинга и характеристики самосборных белковых наночастиц (СБНЧ), предназначенных для разработки вакцин. Описанный метод позволяет представлять тримерные антигены в нативной конформации.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Разработка вакцин
- Инженерия белков
Фон
- Самосборные белковые наночастицы (СБНЧ) перспективны для применения в вакцинах.
- Метод можно адаптировать для различных конструкций СБНЧ.
- Возможно крупномасштабное производство для клинических испытаний.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол очистки и характеристики СБНЧ.
- Способствовать разработке эффективных вакцин против инфекционных заболеваний.
- Обеспечить оценку чистоты и функциональности белков.
Использованные методы
- Ультразвуковая обработка и центрифугирование для лизиса клеток.
- FPLC для очистки белков.
- SDS-PAGE для определения чистоты белков.
- Диализ для рефолдинга СБНЧ.
Основные результаты
- Успешная очистка шесть-спиральных пучков СБНЧ.
- Рефолдинг белков для достижения нативных конформаций.
- Характеристика чистоты белков с помощью гель-электрофореза.
- Возможность адаптации метода для других конструкций СБНЧ.
Выводы
- Метод обеспечивает надежный подход к производству СБНЧ.
- Он поддерживает разработку вакцин с тримерными антигенами.
- Будущие применения могут включать крупномасштабное клиническое производство.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) enable trimeric antigen presentation for vaccine development, addressing the need for structurally authentic immunogens in early discovery. The E. coli-based production system offers a scalable, cost-effective platform for generating vaccine candidates with reduced endotoxin contamination. This approach supports mechanistic de-risking by validating antigen conformation and purity before advancing to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of trimeric epitope presentation and structural fidelity of vaccine antigens.
- Operational Value: Uses E. coli expression to rapidly produce SAPN monomers for functional assessment.
- Predictive Value: Confirms antigenicity via Western blot with monoclonal antibodies, supporting target validation decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates homogeneous SAPN particles (20–100 nm) suitable for standardized antigen display assays.
- Operational Value: Employs DLS, NTA, and TEM for quantitative size and polydispersity measurements, enabling assay reproducibility.
- Platform Value: Facilitates preparation of validated nanoparticle libraries for high-throughput epitope screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates refolding competence and particle assembly under controlled buffer conditions, critical for translational consistency.
- Operational Value: Includes isopropanol wash to reduce LPS, improving safety profile for downstream immunogenicity testing.
- Predictive Value: Confirms multimer formation and antigen accessibility, supporting go/no-go decisions for preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the vaccine discovery continuum from antigen design through lead identification, enabling iterative refinement of trimeric display systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antigen conformation and oligomerization state via FPLC purification and Western blot.
- Screening: Produces monodisperse SAPN preparations for reliable binding and avidity assays in epitope screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative particle size and purity data through DLS, NTA, and SDS-PAGE, enabling comparative analysis across constructs.
- Translational Research: Ensures structural continuity from E. coli-produced monomers to refolded nanoparticles, aligning with preclinical vaccine evaluation.
- Enterprise Reuse: Designed for adaptability across SAPN constructs and transferability to GMP manufacturing, supporting platform-based vaccine development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in antigen presentation through trimeric display and reduced mechanistic ambiguity in immunogen design.
- Operational Value: Standardizes production via sonication, FPLC purification, isopropanol wash, and dialysis refolding, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage de-risking of vaccine candidates before costly preclinical investment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of SAPN-based vaccines based on structural validation and endotoxin clearance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, FPLC operation, and dialysis-based refolding.
- Depends on access to sonicators, FPLC systems with nickel columns, DLS/NTA/TEM instruments, and stain-free SDS-PAGE equipment.
- Necessitates standardization of buffer compositions (imidazole-free, urea-containing, isopropanol wash) across teams for consistent results.
- Involves adaptation considerations for different SAPN constructs, particularly in optimizing elution gradients and refolding kinetics.
- Includes practical limitations such as potential aggregation during refolding and the need for endotoxin reduction beyond isopropanol wash for clinical use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Lysis of E. Coli BL21(DE3) Containing Six-Helix Bundle Self-assembling Protein Nanoparticles
1:24
Protein Purification
5:14
Purity Assessment and Protein Identification
6:28
SHB-SAPN Refolding
7:46
Dynamic Light Scattering (DLS)
8:30
Results: Representative SHB-SAPN Characterization
10:07
Conclusion
