Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

Методы, основанные на атомной силовой микроскопии, позволяет охарактеризовать биомолекулярные процессы в наномасштабе с морфологическим химическим или структурным разрешением, наконец, открыв новое переднее окно наблюдения по биологии. Методы одной молекулы позволяют зондировать высокогетерогенные системы, особенность, которая особенно актуальна для понимания агрегации белка. Объединив отдельные молекулы с подходами к спине, мы можем получить фундаментальную информацию о поведении белков, их связи с болезнью человека и разработать фармакологические вмешательства, которые могут быть успешными.

Кроме того, этот метод может быть успешно применен для изучения химических и структурных свойств биоматериалов для доставки наркотиков, применения и других биотехнологических целей. Это может быть сложной задачей на начальном этапе установить правильные параметры AFM для высокого разрешения, и это легко настроить AFM при измерении фибриллярдных агрегатов. За 30 минут до изображения AFM включите систему AFM и нажмите кнопку настройки и зонда.

В окне изменения зонда нажмите рядом, чтобы подготовить стадию фокусировки. Выключите переключатель пучка AFM, если он находится на и разблокировать замки голубятни. Отключите головную голову от системы и в окне изменения зонда щелкните далее.

Гора кантилевер AFM на держатель зонда. Подключите головную голову к системе и заблокировой замки голубятни. Включите переключатель лазерного луча AFM и в окне изменения зонда, нажмите дальше.

Во всплывающем окне щелкните нет, если тип кантилевера не изменился, и отрегулируйте оптические ручки выравнивания, чтобы найти кантилевер. Отрегулируйте фокус на кантилевер и нажмите далее. В всплывающем окне нажмите "да", если основное внимание уделяется кантилеверу.

Используйте ручки обнаружения лазерного луча для позиционирования лазерного луча в конце кантилевера. Используйте отклоняется лазерный луч ручки, чтобы максимизировать общий сигнал измеряется четыре квадранта фото диод, по крайней мере больше, чем один вольт. В окне изменения зонда щелкните рядом и закройте.

Прождя 15 минут для кантилевера, чтобы достичь тепловой стабильности, скорректировать положение отклоняется лазерный луч на позиции чувствительных фото диод, если это необходимо. Нажмите NCM развертки, выберите желаемую амплитуду колебаний, нажмите кнопку фазы использования и нажмите авто. Настройте кантилевер близко к максимуму своего первого свободного резонанса колебаний примерно до 300 килогерц для кантилевера с пружинной константой 40 ньютонов на метр.

Поместите образец на держатель образца. Нажмите область сканирования и установите разрешение между 256 на 256 и 1024 на 1024 пикселей, а затем установить размер сканирования и число пикселей. Установите скорость сканирования до 0,3 к одному герцу для сканирования области от одного на один до пяти на пять микрометров в квадрате.

Сосредоточьте оптический вид на образец и нажмите на подход, чтобы приблизиться к поверхности образца. Затем нажмите поднимите 100 микрометров, чтобы поднять наконечник AFM на 100 микрометров над поверхностью образца и нажмите расширить оптическое изображение образца. Нажмите на бар фокус-сцены, чтобы сосредоточить представление на поверхности образца и использовать стрелки для перемещения в области образца интереса.

Нажмите подход, чтобы привлечь поверхности и нажмите линии сканирования, чтобы проверить, если кончик следует поверхности хорошо. Отрегулируйте установленную точку по мере необходимости. Затем нажмите сканирование, чтобы начать визуализацию поверхности образца, поддерживая постоянный режим фазовой смены, не превышающей дельту 20 во время изображения, чтобы избежать большой силы изображения и поддерживать согласованность между независимыми образцами.

Для ИК-наноспектроскопии изображения, за 30 до 60 минут до анализа, включите ИК-систему AFM и ИК-лазер. Откройте встроенное программное обеспечение для управления инструментом и нажмите файл и новый, чтобы открыть новый иК-файл nano. Нажмите инициализировать, чтобы начать систему ИК AFM и открыть крышку инструмента.

Намонтировать силиконовый золотой зонд с номинальным радиусом 30 нанометров и пружинной константой 0,2 ньютона на метр на ИК-систему AFM для измерения образца в контактном режиме. Нажмите нагрузки в разделе зонда AFM и далее. Используйте акцент на стрелки зонда, чтобы сосредоточить камеру на кантилевере и использовать наконечник для перекрестия, чтобы поместить перекрестие в конце кантилевера.

Поверните ручки, контролирующие положение лазера обнаружения, чтобы распоидать лазер в конце кантилевера. Поверните лазерные ручки, чтобы обнаружить и максимизировать сумму, измеренную четырех квадрантным фото диодом, до значения, больше трех вольт. Поверните ручку отклонения, чтобы настроить отклонение кантилевера до минус одного вольта и нажмите дальше.

Затем закройте крышку инструмента. Используйте фокус на стрелки зонда, чтобы сосредоточить камеру на образец и наконечник для перекрестия стрелки двигаться в области интересов образца. Нажмите дальше и заниматься.

В окне микроскопа выберите высоту для морфологии, амплитуду две для поглощения ИК и частоту PLL, чтобы сопоставить наконечник для образца контактного резонанса. В разделе AFM установите параметры, продемонстрированные для изображения AFM, и нажмите на сканирование, чтобы получить карту морфологии. Когда морфология отображение закончено, в окне микроскопа, нажмите карту высоты, чтобы распоставить зонд на верхней части одного агрегата.

В разделе ИК нано нажмите кнопку "Начать ИК", чтобы осветить образец ИК-лазером. Чтобы сфокусировать инфракрасный лазер на кантилевере, нажмите оптимизацию и введите 1655 сантиметров для волнового света. Нажмите добавить и сканировать, чтобы определить положение ИК-лазера и нажмите обновление и хорошо, чтобы выровнять свое положение с cantilever.

В общем разделе введите волновой номер, для которого ожидается высокая абсорбация в относительном поле, и деактивировать опцию фильтра прохода полосы. Нажмите начать ИК затем проверить показания счетчика и FFT реакции кантилевера. В окне FFT переместите зеленый курсор, чтобы прочитать резонансную частоту кантилевера.

Типичное значение FFT резонанса кантилеверов составляет около 200 килогерц. Введите генерируемое значение частоты резонанса в общем разделе в поле центра частоты и используйте частотное окно 50 килогерц. Нажмите лазерного импульса настроить окно, чтобы выбрать резонанс расширенный режим и установить скорость пульса 222 килогерц, диапазон настройки 50 килогерц и лазерный цикл службы 5%Нажмите приобрести, чтобы подмести пульс лазера.

Используйте курсор для настройки лазерного импульса на частоту механической реакции теплового расширения образца, поглощая ИК-свет. Затем выберите фазу заблокирован цикл для мониторинга контактного резонанса между образцом и кончиком и нажмите ноль. Для других химических свойств в нано-масштабе, отслеживать контактный резонанс во время приобретения спектров, чтобы гарантировать, что спектр образца не зависит от перегрева и размягчения.

Выберите позволяют отслеживать образец наконечник контакт резонанса и выбрать интегральный выигрыш 0,5 и пропорциональное увеличение 10 затем нажмите OK. В окне оптимизации щелкните длину волны и сканируйте, чтобы найти ИК-лазер по крайней мере для трех волновых намерий, соответствующих основным диапазонам абсорбанса образца и по крайней мере для одного волнового номера для каждого чипа лазера. Нажмите инструменты, ИК фон калибровки и новые, и установить волновые намерия между 1200 и 1800 сантиметров. Установите фоны в среднем до одного, цикл службы 5%и скорость развертки до 100 сантиметров в квадрате.

Нажмите приобрести для измерения ИК лазерного фона для нормализации измеренной нано шкалы локализованных спектров, сохранить файл и закрыть окно. В ИК-спектрах выберите разрешение ИК-спектра от одного до четырех сантиметров и ряд со-средних показателей не менее 64 раз. Затем нажмите приобрести для измерения нано-шкалы локализованного спектра ИК в диапазоне белка.

Чтобы получить наномасштабную химическую карту, выберите 1655 сантиметров и ИК-изображения и нажмите сканирование в окне сканирования AFM. Когда отображение будет завершено, сохраните измерения. Затем используйте встроенное программное обеспечение для обработки изображений AFM для анализа приобретенных карт морфологии, контактного резонанса и химии и локализованных спектров наномасштаба.

Это критический шаг для получения очень чистого мономерного решения, так как наличие агрегированных видов может привести к плохой воспроизводимости кинетики и ввести артефакты в ваши измерения. Фундаментальным фактором для успешного изучения биологических образцов, которые имеют высокую неоднородность, является правильное положение твердых субстратов. Микрофлюидное осаждение брызг может быть использовано вместо ручного, чтобы сохранить архитектуру образца и неоднородность.

Эти методы прокладывают путь для распутывания химической структуры и свойств отдельных биомолекул и их взаимодействия в физиологической и родной жидкой среде.