Иммунофлуоресценция Маркировка человека и Минин Нейтрофил Внеклеточные ловушки в парафин-встроенные ткани

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) являются трехмерными структурами, генерируемыми стимулируемыми нейтрофил гранулоцитами. В последние годы стало ясно, что NETs вовлечены в самые разные заболевания. Обнаружение NET в тканях может иметь диагностическую значимость, поэтому необходимы стандартизированные протоколы для маркировки компонентов NET.

Сегодня мы хотели бы показать вам варианты общего протокола поиска антигена, вызванного теплом. Он сочетает в себе преимущества более низкой температуры для антигена нейтрофиловой эластазы и высокое значение рН, которое требуется для гистонов. Этот метод позволяет изучать NETs, нейтрофил внеклеточные ловушки, в парафиновых тканях как от мыши, так и от мужчин.

Кроме того, рассматривается возможность изучения архивных материалов или ретроспективных исследований. Во-первых, поместите подготовленные слайды в стеллажи и подпомить их в средствах массовой информации, используемых для обезвоживания и очистки в обратном порядке в течение пяти минут каждый. Затем нагрейте водяную баню с контролируемой температурой горячей пластиной до 70 градусов по Цельсию.

Поместите банку, наполненную тепловым эпитопным буфером и 10%глицеролом, в водяную баню. Когда буфер достиг 70 градусов по Цельсию, поместите стойку со слайдами в буферную банку. Инкубировать горки при 70 градусах по Цельсию в течение 120 минут.

После этого снимите банку с водяной бани и дайте ей остыть до комнатной температуры. Промыть охлажденные секции три раза с ионизированной водой и один раз с TBS. Использование проката фильтровальной бумаги или ватный тампон, тщательно удалить любую жидкость между разделами на слайдах, убедившись, что оставить разделы гидратированных.

Затем используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы создать барьер вокруг каждого раздела. Инкубировать раздел в блокировании буфера при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Разбавить первичные антитела в блокировании буфера при концентрации одного микрограмма на миллилитр.

Удалите блокирующий буфер со слайдов и добавьте разбавленные первичные антитела, убедившись, что они используют достаточный объем для предотвращения высыхания. Закройте влажный контейнер и инкубировать на ночь при комнатной температуре. На следующий день, мыть разделы три раза с TBS с каждой стирки продолжительностью пять минут.

Подготовь рабочий раствор вторичных антител в блокирующий буфер. Обложка тканей разделов с вторичным раствором антитела, и передать слайды во влажный контейнер. Печать влажный контейнер, и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.

После этого, мыть разделы три раза с TBS и один раз в воде с каждой стирки продолжительностью пять минут. Обложка промывают разделы с монтажной среды, и применять крышку стекла, избегая при этом образование пузыря. После того, как монтажная среда затвердеет, используйте конфокальный микроскоп или широкое поле микроскопа с соответствующими фильтрами прохода полосы для анализа иммунофлуоресценции.

Чтобы оцифровать полные разделы с помощью сканера слайдов, установите интенсивность флуоресценции с помощью отрицательного и положительного контроля. Используя окрашивание нейтрофиловой эластазы, найдите богатые нейтрофилами области и увеличьте масштаб этих областей, чтобы проверить, является ли сигнал нейтрофиловой эластазы гранулированным или внеклеточным. Если сигнал внеклеточный и перекрывается как с гистоном, так и с окрашиванием ДНК, то были получены внеклеточные ловушки нейтрофила.

В этом исследовании компоненты NET успешно обнаруживаются в парафин-встроенных тканях, как человеческого, так и муринового происхождения. Если секции тканей имеют толщину от двух до трех микрометров, они могут быть проанализированы с помощью широкоугольной микроскопии с использованием 10x или 20x целей. Для правильной оценки окрашивания были обработаны как отрицательные, так и положительные образцы.

Репрезентативная секция ткани аппендицита человека показывает ткани, окрашенные для NE, H2B и Hoechst 33342. Изображения слева из области раздела, содержащего NETs, в то время как изображения справа из другой области того же раздела, который содержит многочисленные нейтрофилов, но не NETs. Области с массивным образованием NET можно легко найти даже при низких увеличениях, так как все три компонента NET часто колкализируются в тягучих внеклеточных структурах.

Это проявляется в наложении трех каналов как беловатые внеклеточные волокна, которые могут быть количественно с помощью программного обеспечения анализа изображений для создания фиолетовой накладки с использованием пикселей от перекрывающихся сигналов, которые являются положительными для зеленого, красного и синего. Для более высокого разрешения, конфокальные микроскопы или широкое поле микроскопы с деконволюцией должны использоваться, чтобы свести к минимуму вне фокуса размытия. Максимальная проекция конфокального стека богатой NET области из того же образца аппендицита человека показывает, что NE находится в гранулах, но также в изобилии extracellularly, где он колокализируется с H2B и с ДНК.

Внеклеточная колокализация приводит к беловатым цветовым сочетаниям. Пиксели, положительные для зеленого, красного и синего, могут быть вновь использованы для создания фиолетовой накладки, представляя NETs. Репрезентативная деталь центрального сечения из легкого мыши, инфицированного туберкулезом Микобактерия, является еще одним примером того, как колокализация всех трех компонентов NET хорошо видна как беловатые области между нейтрофилами, которые могут быть использованы для создания фиолетового слоя, указывающего НАТ.

Во время процедуры окрашивания, разделы не должны падать сухой, потому что это вызовет ложноположиние окрашивания или высокий фон. Анализ архивных материалов может помочь понять влияние NETs на болезни. Потому что парафиновая ткань может иметь огромный фон, важно иметь положительный и отрицательный контроль, который вы можете различать окрашивание и фон.

Деваксинг и обезвоживание должны выполняться под дымовой капот. Убедитесь в том, чтобы носить перчатки и лабораторное пальто.