Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans
6 августа 2019 г.
Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.
Этот протокол позволяет бесшовной изоляции, культивирования и допроса транскрипционных ответов в конкретной линии клеток от C.elegans. Основным преимуществом этого протокола является высокий уровень адаптации к различным стадиям жизни червей или конкретных типов клеток, которые должны быть изолированы. Демонстрацией процедуры будет я и Наталья Захайко, техник из нашей лаборатории.
После сбора животных, центрифуга их на 1600 раз г в течение пяти минут. Удалите все супернатанты и повторно помесить червей в один миллилитр M9 средств массовой информации. Перенесите подвеску в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Центрифуга в 1600 раз г в течение пяти минут, чтобы гранулировать червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DTT и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Черви теперь должны казаться морщинистыми вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
Далее добавьте 800 микролитров ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкивая трубку. Центрифуга при 13 000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты, чтобы гранулировать червей. Удалить супернатант и промыть одним миллилитром буфера изоляции.
Повторите процесс центрифугации и мытья в общей сложности пять раз, убедившись, что тщательно удалить буфер изоляции каждый раз. После этого добавьте в гранулы 100 микролитров протеазной смеси из Streptomyces griseus, растворенных в буфере изоляции. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут, убедившись, что применять механические нарушения путем трубопроводов вверх и вниз от 60 до 70 раз с 200-микролитер микропипетр кончиком против нижней части трубки.
Чтобы определить стадию пищеварения, удалите от одного до пяти микролитров смеси пищеварения, опустите его на стеклянную горку и осмотрите с помощью микроскопа культуры тканей. Через пять-семь минут фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу, и навоз клеток будет легко виден. Остановите реакцию, добавив 900 микролитров коммерчески доступных L-15 среды Лейбовица, дополненный 10%FBS и пенициллин-стрептомицин.
Центрифуга при 10 000 раз г и при четырех градусах По Цельсию в течение пяти минут гранулировать изолированные фрагменты и клетки. Вымойте гранулы клетки в два раза больше с холодной L-15 дополнительных средств массовой информации с использованием одного миллилитра средств массовой информации на стирку. Переусердуйте гранулы клеток в один миллилитр L-15 дополнительных средств массовой информации, и оставить на льду в течение 30 минут.
Затем возьмите верхний слой, который составляет примерно от 700 до 800 микролитров, и перенесите его в трубку микроцентрифуга. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемацитометр для измерения плотности клеток от 10 до 25 микролитров изолированных клеток. Центрифуги клетки из изолированной клеточной суспензии при 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и будем повторно использовать гранулы клеток L-15, дополнив их плотностью не более шести миллионов клеток на миллилитр, чтобы избежать перегрузки цитометра потока. Затем сортируют клетки по GFP-положительному выражению с помощью цитометра потока, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве элемента управления для анализа, не тип клетки.
После этого, пластины изолированных клеток в колодцы стерильной пластины шесть скважин, поместите пластину в пластиковый контейнер, добавить влажную салфетку или мягкую бумагу ткани, чтобы добавить влагу в клетки, и инкубировать при 20 градусов по Цельсию. Клетки центрифуги из изолированной клеточной подвески в 1,5-миллилитровой микроцентрифуге без RNase в 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используя микропипют, удалите супернатант и добавьте 100 микролитров среды M9, чтобы смыть L-15 дополненной среды.
Затем центрифуга клетки на 10000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и удалить супернатант. Повторите этот процесс мытья и центрифугации в три раза больше, чтобы убедиться, что все средства массовой информации удаляется, убедившись, что тщательно удалить супернатант каждый раз. Затем добавьте один миллилитр фенола и гуанидина изотиоцианат раствора в клетки и пипетки подвески вверх и вниз тщательно.
Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. После этого добавьте 250 микролитров хлороформа и аккуратно инвертировать трубку от 15 до 20 раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Используйте micropipette тщательно удалить как можно больше верхнего aqueous слой, как это возможно, убедившись, что не беспокоить нижней органических слоев. Перенесите нижний слой в новую микроцентрифугную трубку без 1,5 миллилитров RNase.
К новой трубке добавьте 500 микролитров изопропанола и перемешайте трубку. Инкубировать этот раствор при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифуга трубки на 14000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Поместите образцы на лед и используйте микропипюту, чтобы удалить как можно больше изопропанола. Аккуратно добавьте один миллилитр 70% этанола в RNase-бесплатно двойной дистиллированной воды в трубку, применяя его в сторону трубки. Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Удалите большую часть этанола и дайте трубке высохнуть на льду в течение трех-пяти минут. После этого добавьте от 15 до 20 микролитров воды без RNase. Используйте спектрофотометр на 260 нанометров для измерения концентрации и чистоты РНК.
В этом исследовании, unc-17:GFP-положительные холинергические нейроны извлекаются и изолированы от круглого червя C.elegans для последующих исследований ex vivo. Ген unc-17 выражен по всему телу C.elegans, и коды для везикулярного ацетилхолина трансмембранного транспортера. Выражение этого гена можно наблюдать в головах, середине тела и хвостовых нейронах, а также в проекциях нейронов.
Здесь показаны репрезентативные микрографы флуоресценции некон-17:GFP-положительных нейронов после изоляции, а также соответствующий отрицательный контроль со стороны неизмененных животных N2 дикого типа. Изолированные клетки могут оставаться в живых до трех дней, когда дополняется L-15 Лейбовица среднего и 10%FBS. Здесь показаны репрезентативные данные qPCR от GFP-экспрессинг холинергических нейронов, а также GFP-экспрессинговых мышечных клеток.
После успешной сортировки клеток РНК изолируются с помощью метода фенола и гуанидина изотиоцианата, после чего кДНК вырабатывается с помощью синтеза. Выражение холинергических нейронов конкретных генов, tph-1, триптофан гидроксилазы, и snb-1, синаптический транспортер пузырьков, поднимается в unc-17:GFP изолированных клеток. Однако это выражение не присутствует в изолированных клетках myo-3:GFP.
Обратное верно с выражением мышечно-специфической миозин-тяжелой цепи стенограммы мио-2, так как экспрессия этого гена ограничивается изолированными мышечными клетками, но не изолированными холинергическими клетками. Важно, чтобы инкубировать червей в полном объеме. Однако, расширенная инкубация кутикулы червя может привести к смерти червя или дополнительного стресса для животного.
После изоляции, клетки могут быть либо культурны в течение определенного периода времени, или использоваться для изоляции РНК и qRT-PCR анализа. Культурные нейроны могут быть дополнительно проанализированы с помощью измерений электрофорезного зажима патча. Этот метод может облегчить анализ ex vivo конкретных групп клеток, тем самым помогая улучшить наше понимание клеточных реакций в контексте многоклеточных организмов на различных этапах своего жизненного цикла.
Поскольку в ходе этого эксперимента используются такие химические вещества, как SDS и DTT, следует соблюдать общие лабораторные процедуры безопасности при создании и использовании буферов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол позволяет осуществлять эффективную изоляцию, культивирование и анализ транскрипционных ответов специфической клеточной линии C.elegans. Метод может быть адаптирован для различных стадий жизненного цикла червей или конкретных типов клеток, подлежащих изоляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Трансгенные организмы
Теоретические основы
- Изоляция специфических нейронных клеток имеет решающее значение для изучения их функций.
- Трансгенные линии Caenorhabditis elegans, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, облегчают этот процесс.
- Исследования изолированных нейронов ex vivo позволяют получить представление об их поведении и свойствах.
- Данный протокол расширяет возможности изучения специфических популяций нейронов.
Цель исследования
- Представить надежный метод выделения живых нейрональных клеток.
- Обеспечить возможность дальнейшего краткосрочного культивирования выделенных клеток.
- Облегчить проведение различных исследований ex vivo, сосредоточенных на специфических нейронах.
Используемые методы
- Сбор трансгенных C.elegans, экспрессирующих GFP.
- Центрифугирование собранных животных при 1600 ×g в течение пяти минут.
- Ресуспендирование червей в среде M9.
- Перенос суспензии в микроцентрифужные пробирки для дальнейшей обработки.
Основные результаты
- Успешная изоляция специфических популяций нейронов.
- Адаптируемость протокола к различным стадиям развития и типам клеток.
- Возможность детального транскрипционного анализа изолированных клеток.
- Углубление понимания функций нейронов посредством исследований ex vivo.
Выводы
- Данный протокол предлагает простой подход к выделению нейрональных клеток.
- Он открывает возможности для дальнейших исследований поведения и свойств нейронов.
- Адаптируемость метода делает его подходящим для широкого спектра исследований в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция специфических популяций нейронов из модельных организмов позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней, устанавливая связь между генетическими пертурбациями и функциональными фенотипами. Такой подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет получения количественных транскрипционных данных, специфичных для конкретных типов клеток, что позволяет эффективно проводить сортировку гипотез. Адаптируемость данного метода к различным типам клеток и стадиям развития организма обеспечивает трансляционную преемственность при доклиническом моделировании нейродегенеративных процессов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать клеточно-специфические транскрипционные ответы для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей в определенных популяциях нейронов.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый рабочий процесс для выделения живых холинергических нейронов *C. elegans* для последующего функционального анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать очищенные лизаты нейронов, подходящие для анализа методом qPCR, что обеспечивает количественный скрининг генетических или фармакологических воздействий.
- Практическая ценность: стандартизирует изоляцию клеток с помощью FACS или магнитной сепарации, снижая вариабельность анализа ex vivo в различных экспериментах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает моделирование систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем выделения нейронов, вовлеченных в дисфункцию, связанную со старением, что способствует поиску биомаркеров.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять краткосрочное культивирование выделенных нейронов, что делает возможным проведение исследований транскрипционных или электрофизиологических изменений во временной динамике.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений — за счет обеспечения механистического считывания данных из генетически определенных популяций нейронов.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы путем изоляции нейронов, меченных GFP, для измерения изменений экспрессии генов после воздействия.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные образцы нейронов, подходящие для высокочувствительных транскрипционных анализов.
- Аналитика: обеспечивает количественное определение выхода и чистоты РНК с помощью спектрофотометрии, что способствует нормализации и сравнению данных.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность в доклинических исследованиях за счет изоляции нейронов из моделей старения для изучения консервативных путей нейрональной дегенерации.
- Корпоративное повторное использование: адаптируемые системы «промотор-GFP» позволяют использовать метод для различных типов нейронов и стадий развития, повышая полезность платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем связывания транскрипционных изменений с конкретными популяциями нейронов, что повышает достоверность выбора мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированное выделение живых клеток с использованием общепринятых методов сепарации, что повышает воспроизводимость.
- Стратегическая ценность: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние функциональные данные по конкретным типам клеток, что снижает риски гипотез относительно мишеней.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации мишеней с учетом рисков на основе валидации нейрональных путей в генетически доступной системе.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трансгенными моделями, методами сортинга клеток с флуоресцентной активацией и методами выделения РНК.
- Зависит от наличия проточных цитометров или систем магнитного разделения, совместимых с малообъемными образцами нейронов.
- Необходимо стандартизировать протоколы дигестии и промывки для обеспечения стабильного выхода и жизнеспособности клеток в разных партиях.
- Адаптация метода для других типов нейронов зависит от доступности линий с GFP под специфическими промоторами и оптимизации условий диссоциации.
- Практические ограничения включают короткое окно жизнеспособности после выделения и возможный стресс, вызванный этапами механической и ферментативной диссоциации.
