Средняя подготовка к культивированию микроорганизмов в строго анаэробных/аноксических условиях
15 августа 2019 г.
Поскольку обязыванные анаэробные организмы не могут расти при воздействии кислорода, использование анаэробных методов культивирования является необходимым. Здесь мы демонстрируем простой и эффективный метод культивирования смешанной культуры, полученной из биогазового растения от подготовки средств массовой информации к газу и квантификации летучих жирных кислот.
В отличие от аэробных организмов, строго анаэробные микроорганизмы требуют отсутствия кислорода. Поскольку кислород повсеместно находится в воздухе, сохранение условий, свободных от кислорода во время культивирования, является предпосылкой для анаэробного культивирования. Применяемый метод представляет собой простой и недорогой метод для обеспечения аноксических условий для выращивания смешанной микробной популяции в жидкой культуре.
Этот метод также может быть применен для выращивания чистых культур. Однако для высокочувствительных к кислороду микроорганизмов эта процедура может быть не применима. Начните с взвешивания средних ингредиентов в соответствующей колбе и растворив их с половиной объема дистиллированной воды.
Затем добавьте миллилитр индикатора REDOX, за которым последуют витамины в растворе микроэлементов. Отрегулируйте рН в соответствии с требованиями организма и доввейте конечный объем до 1 литра дистиллированной водой. Цвет индикатора REDOX зависит от рН и может потребовать некоторого времени для настройки.
Заполните 120 миллилитров сыворотки колбы с 50 миллилитров среды, а затем инкубировать их в 100 градусов по Цельсию водяной бане в течение 20 до 30 минут, чтобы уменьшить solubility кислорода в жидкой фазе. Промыть пространство головы азотом. Позаботьтесь о соответствующей вентиляции комнаты при работе с азотом.
Закройте колбы с бутил резиновой септой, и исправить алюминиевые колпачки. Затем добавьте 0,1 миллилитров уменьшаемого агента к каждой колбе, чтобы еще больше уменьшить потенциал REDOX. И автоклав колбы в течение 20 минут при 121 градусов по Цельсию.
При применении этого протокола необходимо использовать автоклав, сертифицированный для стерилизации закрытых судов. В противном случае чрезмерное давление, полученное в результате повышения температуры, может привести к взрыву фляг сыворотки. Для приготовления инокулы из анаэробного реактора добавьте в колбу 400 миллилитров дистиллированной воды и довлейте ее до кипения.
Охладить его примерно до 30 градусов по Цельсию, постоянно промывая пространство головы азотом. Добавьте около 100 граммов шлама, полученного из анаэробного реактора, убедившись, что записывает точную массу шлама для определения разбавления. Обменять головное пространство колбы азотом и закрыть его с помощью бутыльной резиновой перегородки.
Встряхните колбу в течение 30 минут при 120 об/мин. Пусть большие частицы шлама отложений, а затем использовать шприц и канулу, чтобы удалить 5 миллилитров инокулума и ввести его в ранее подготовленную колбу сыворотки. Инкубировать привитой колбе сыворотки при соответствующей температуре для эксперимента, убедившись, что слить над давлением, вызванным повышением температуры, примерно через 15 до 30 минут после начала инкубации.
Оценить добычу и состав биогаза во время инкубации, зафиксировать текущее атмосферное давление и подготовить манометр для оценки давления внутри колбы. Встряхните колбы и удалите 1 миллилитр головного космического газа с помощью шприца и канулы. Измерьте концентрацию водорода, кислорода, метана и двуокиси углерода с помощью газовой хроматографии.
Используйте 1 миллилитр жидкости из колбы для мониторинга концентрации всех высоких жирных кислот, в соответствии с рукописными указаниями, и слейте колбы над давлением после возвращения его к соответствующей температуре. Этот протокол был использован для создания миниатюрных биореакторов, проводящих анаэробные пищеварения. Триптофан, тирозин, фенилаланин, экстракт мяса и кейсин были добавлены в 3 различных концентрациях, а производство метана контролировалось в течение 28-дневного инкубационного периода.
Метаногены визуализировались путем излучения коэнзима F420, который является носителем электронов в метаногенезе, и демонстрирует сине-зеленую флуоресценцию с максимальным поглощением на 420 нанометров. Параллельно с анализом газа были проанализированы образцы летучих жирных кислот и концентраций фениловой кислоты в инкубационный период. Молекулярные биологические методы, направленные на обилие конкретных микроорганизмов и/или состав микробного сообщества, в определенный момент эксперимента могут применяться с помощью описанной процедуры.
Обзор
В данной статье представлен простой метод культивирования анаэробных микроорганизмов, полученных с биогазовой установки. Подробно описаны подготовка сред, а также количественное определение газа и летучих жирных кислот.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Биотехнология
- Экология
Теоретическая часть
- Анаэробные организмы не могут выживать в присутствии кислорода.
- Поддержание аноксических условий имеет решающее значение для их культивирования.
- Данный метод прост и экономичен для смешанных популяций микроорганизмов.
- Его также можно адаптировать для чистых культур.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективный протокол анаэробного культивирования.
- Количественно определить выход биогаза и содержание летучих жирных кислот.
- Визуализировать метаногены в ходе процесса.
Используемые методы
- Приготовление анаэробных сред с окислительно-восстановительными индикаторами.
- Инокуляция илом из анаэробных метантенков.
- Мониторинг состава газа с помощью газовой хроматографии.
- Анализ летучих жирных кислот в процессе инкубации.
Основные результаты
- Было достигнуто успешное культивирование анаэробных микроорганизмов.
- Производство биогаза контролировалось в течение 28 дней.
- Были количественно определены концентрации метана и летучих жирных кислот.
- Визуализация метаногенов проводилась с помощью методов флуоресценции.
Выводы
- Описанный метод эффективен для культивирования анаэробных культур.
- Он позволяет оценить выход биогаза и состав микробного сообщества.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных областей анаэробных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежное культивирование строго анаэробных микроорганизмов имеет важное значение для биофармацевтических исследований и разработок&направлен на изучение микробного метаболизма, синтетическую биологию и инновации в области биопроцессов. Данный протокол обеспечивает воспроизводимое приготовление бескислородных сред и количественный мониторинг продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, что способствует раннему поиску и механистическому снижению рисков в рабочих процессах с использованием анаэробов. Масштабируемость и стандартизация метода облегчают его интеграцию в системы скрининга корпоративного уровня и в конвейеры трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность проверки гипотез относительно анаэробных метаболических путей и функций микроорганизмов.
- Снижает биологические риски за счет поддержания строгих аноксических условий для чувствительных объектов исследования.
- Способствует функциональной валидации микробных консорциумов, имеющих значение для разработки биопроцессов и терапевтических средств.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое приготовление анаэробных сред для последующих анализов.
- Гарантирует количественное измерение выхода газов и метаболитов для надежной оценки соединений.
- Поддерживает масштабируемость анализа и повторное использование платформы в различных анаэробных системах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает сопоставление микробных выходных данных с трансляционными биомаркерами, такими как метан и летучие жирные кислоты.
- Поддерживает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации в приложениях на основе анаэробов.
- Снижает риски при продвижении микробных кандидатов за счет предоставления надежных количественных данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол определяет анаэробное культивирование как базовый метод, применяемый на всех этапах: от первоначального поиска до идентификации ведущих соединений и проведения доклинических исследований.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение метаболических путей за счет возможности строгого контроля окислительно-восстановительного потенциала и уровня кислорода.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты при анализе газов и метаболитов, поддерживая готовность метода к проведению анализа.
- Аналитика: Объединяет газовую хроматографию и ВЭЖХ для точного измерения микробной активности и продуктов метаболизма.
- Трансляционные исследования: Сопоставляет результаты микробного синтеза с доклиническими конечными точками, имеющими значение для разработки биопроцессов и терапевтических средств.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает повторно используемый стандартизированный рабочий процесс для анаэробного культивирования в R&D-программы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при изучении анаэробных систем.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, масштабируемое и воспроизводимое анаэробное культивирование и анализ.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию и продвижение активов на основе анаэробов с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области анаэробной микробиологии и владение методами асептической техники.
- Необходим доступ к газонепроницаемым колбам, автоклавам для закрытых сосудов и аналитическим платформам (ГХ, ВЭЖХ).
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для поддержания аноксических условий и обеспечения воспроизводимости результатов.
- Может потребоваться адаптация метода для штаммов с высокой чувствительностью к кислороду или альтернативных модельных систем.
- Обязательно соблюдение протоколов безопасности при работе с азотом и газами под давлением.
