ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Это исследование было поддержано Американской ассоциацией легких и Американского торакального общества награды LS. Авторы искренне хотят поблагодарить доктора Джека Элиаса и доктора Чун Кын Ли за предоставление трансгенных штаммов мыши.

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC в Медицинской школе йельского университета.
1. Коллекция образцов мышей
<ol><li>
Анестезия
	<ol>
<li>Анестезия мышей с использованием кетамина и ксилазина (100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Сбор образцов крови
	<ol>
<li>Подтвердите глубину анестезии неотзывчивостью к щепотке ног.</li>
		<li>Хирургически открыть грудную полость, чтобы разоблачить сердце.</li>
		<li>Вставьте 26,5 G иглу в левый желудочек и соберите кровь в шприц. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, около 0,5-1 мл крови можно собрать из здорового 20-25 г мыши.</li>
		<li>Сбор крови в гепаринизированных трубах, для сбора плазмы, или негепаринизированных труб для сбора сыворотки.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Коллекция бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (BAL)
	<ol>
<li>Чтобы собрать BAL, сделать вертикальный разрез на шее, чтобы разоблачить трахеи.</li>
		<li>Cannulate трахеи с 22 G катетер и закрепите его твердо с помощью строки для того, чтобы предотвратить утечку из носа мыши.</li>
		<li>Медленно введите два аликота стерильного фосфатного солей (PBS, 0,75 мл каждый) в легкие через трахею и извлекайте обратно.</li>
		<li>Бассейн aliquots и держать на льду для дальнейшего анализа.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Обработка биологических образцов.
	<ol>
<li>Образец крови: либо свежий (плазма) или после разрешения свертывания в течение 4 ч (сыворотка), центрифуга при 600 х г в течение 10 мин. Возьмите супернатант и либо заморозить для хранения или использовать для эксперимента.</li>
		<li>BAL: Центрифуга образец на 350 х г в течение 5 мин. Возьмите супернатант и либо заморозить для хранения или использовать для эксперимента.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Читиназа Ассей
ПРИМЕЧАНИЕ: Наука, лежащая в основе асссея, относительно проста. Нефлуоресцентный субстрат расщепляется ферментативно активной хитиназы для производства флуоресцентного продукта, который затем измеряется как косвенный маркер активности хитиназы. Хитиназа в образцах сломать субстрата 4-метилумбелайлилл-D-N, N'-diacetylchitobiose присутствует в буфере 1x McIlvain. Высвобождается флуоресцентная молекула 4-метилумбелийрил. Измеряя общую флуоресценцию каждой скважины, мы получаем точное измерение активной хитиназы в каждом образце. Поскольку распад хитина за хитиназой является гидролитической реакцией, стоп-буфер, смесь 0,3 М глицина и NaOH (12,0 г/л при рН 10,6), завершает распад хитина, создавая среду, которая слишком базова для работы фермента.
<ol><li>
Подготовьте субстраты, стандарты и решения.
	<ol>
<li>Подготовьте буфер McIlvain. McIlvain Buffer состоит из 0,1 М цитрат и 0,2 М фосфата при рН 5,2. Разбавить в соотношении 1:1 для буфера 1x McIlvain.</li>
		<li>Растворите как 4-метилумвелайлайлайл-D-N, N'-diacetylchitobiose и 4-метилумбелайлил з-Д-Н, N', N"-triacetylchitotriose в 1x McIlvain буфера до концентрации 500 мкм каждый. ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковое решение может храниться при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего использования; лучше всего хранить в aliquots.</li>
		<li>Растворите стандартный, 4-метилюмбеллиферон, до концентрации 0,1 мМ в стоп-буфере (смесь 0,3 М глицина и NaOH (12,0 г/л при рН 10,6)) для создания стандартного раствора кривой запаса.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Создайте и наплитуйте рабочее решение.
	<ol>
<li>Комбинат 1x McIlvain буфера и хитина субстрата 4-метилумбелиферил-D-N, N'-diacetylchitobiose для создания рабочего решения. На каждые 10 образцов смешайте 100 кЛ субстрата с 2,17 мл 1x буфера McIlvain. См таблица 1 для дополнительных расчетов на основе размера выборки. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 4-метилумбелиферил ю-D-N, N', N"-триацетилхитотиоз для человеческих образцов. Хотя оба субстрата могут быть расщеплены либо человеческими или мышиными ферментами, они были назначены для образцов человека или мыши на основе эффективности расщепления6.</li>
		<li>Пипетка 95 л рабочего раствора в каждую скважину пластины из 96 колодцев.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Добавьте образцы биоспециции к рабочему раствору.
	<ol>
<li>Затем добавьте 5 кЛ испытательного образца (кровь/BAL/tissue lysate/other биологическая жидкость) к каждому колодцу.</li>
		<li>Смешайте образец в рабочее решение для получения наиболее точных и надежных результатов. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть запущены в дубликаты / трипликаты с особым вниманием к потенциальным эффектам края. Все образцы должны быть предварительно разогреты, чтобы свести к минимуму эффект края. Поскольку анализ включает в себя реакцию между хитиназами в образце и субстратом в рабочем растворе, лучше всего работать относительно быстро, чтобы свести к минимуму разницу во времени, когда первый образец покрылся и последний образец покрыли. Рекомендуется многоканальный пипетка.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Инкубировать при 37 градусах Цельсия.
	<ol>
<li>Накройте тарелку и встряхните кратко (5 с).</li>
		<li>Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Это позволяет проводить ферментативную реакцию.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовьте стандартную кривую.
	<ol>
<li>В то время как образцы инкубации, подготовить серийное разбавление 4-метилумбеллиферон, стандарт часто используется в фторметрическом определении активности фермента.</li>
		<li>Разбавить запас стандартного раствора в стоп-буфере до концентрации 5 мкм.</li>
		<li>Выполните серию разбавлений, как указано в таблице 2. Добавить компоненты в указанном количестве и хорошо перемешать. ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая помогает гарантировать, что измеренные образцы попадают в линейный диапазон стандартной кривой.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Остановите реакцию стоп-буфером.
	<ol>
<li>Добавьте 200 юл стоп-буфера к каждой скважине, чтобы остановить реакцию.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Плита стандартов.
	<ol>
<li>Добавьте 300 кл.с каждого стандарта в колодец в дубликатах на одной тарелке.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Прочитайте пластину с помощью флюорометрического считывателя.
	<ol>
<li>Прочитайте пластину при возбуждении 360 нм, а выброс 455 нм.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Анализ данных
<ol><li>
Вычесть пробелы
	<ol>
<li>Среднее значение дубликатов стандартных разбавлений, которые не имеют 4-метилюмбеллиферона. Вычесть это значение из всех других зарегистрированных значений.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Возьмите в среднем технические реплики и график стандартов.
	<ol>
<li>Среднее два показания для каждой концентрации и график среднего чтения по концентрации. ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный участок должен выглядеть линейным и иметь значение R 2, близкое к 1. В противном случае может возникнуть необходимость переделать стандарты и перечитать табличку, чтобы обеспечить качество анализа данных.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Стандартизировать значения считываемого.
	<ol>
<li>Создайте наиболее подходящее для данных о начертанных стандартах. Разделите считывательные образцы по склону наиболее подходящей линии.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Сравните значения из контрольной и переменной группы.
	<ol>
<li>Используйте t-test или ANOVA для более чем двух групп, чтобы определить, является ли разница между группами статистически значимой. Значения будут принимать единицы nmol/mL'h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

Ни один.

Активность читиназа стала важным биомаркером для прогнозирования тяжести заболевания, прогрессирования заболевания, терапевтической эффективности и наличия специфических патогенов18. Хотя многие из давно постулируемых теорий о роли хитиназ не были экспериментально доказаны19, новые исследования предоставили важные идеи о роли хитиназов и хитиназ, как белки при различных заболеваниях2, 9,<sup class="xref"...

Читин является вторым наиболее распространенным полисахаридом на земле после целлюлозы, выступающей в качестве основного структурного компонента различных организмов, включая экзоскелет насекомых, грибов, дрожжей и водорослей; некоторые позвоночные также имеют хитин1. Читиназы представляют собой семейство ферментов, которые способны разрушать хитин и высоко сохраняются на протяжении всей эволюции в видах, начиная от бактерий до млекопитающих2,3. В дополнение к хитиназы, млекопитающие также имеют хитиназы, как белки, которые похожи на хитиназы в их способности связывать хитин, но отличаются тем, что они не имеют ферментатической способности расщеплять хитин4.
Хотя хитин и хитиназы уже давно изучены, исследования датируются началом 1900-х годов, основное внимание уделяется их роли в насекомых и других беспозвоночных. В самом деле, он не был до 1960-х годов, когда позвоночные были найдены, что хитиназа на всех. Использование цитобиазного анализ, хитиназы были показаны, чтобы быть найдены в пищеварительном тракте ряда позвоночных, включая ящериц и черных дроздов-наблюдение предположил, что из-за потребления хитина содержащих организмов, таких как насекомые5 .
Млекопитающие имеют две ферментативно активные формы хитиназы: кислую хитиназу млекопитающих (AMCase; также известный как CHIT2 и CHIA) и chitotriosidase (CHIT1)4. Оба этих белка способны гидролизовать хитин. Тем не менее, CHIT1 более ферментативно активен у людей, где почти вся активность хитиназы происходит от CHIT1. 4 У мышей, как Chit1 и AMCase почти в равной степени способствовать общей активности хитиназы6. С другой стороны, хитиназоподобные белки не имеют хитиназной активности.
Chit1 в основном выделяется макрофагами и часто считается иммунным ответом на хитинсодержащие патогены7. Фермент также было показано, что участвует в созревании моноцитов в обоих M1 и M2 макрофаг подтипов, даже без присутствия субстрата хитина8. Кроме того, он также может быть вовлечен в созревание других иммунных клеток, включая T помощник типа 2 (Th2) клетки и эозинофилы, как было показано в случае криптококковой инфекции легких9. Эти исследования указывают на сложную роль хитиназав в иммунной системе.
В последние годы, Chit1 уровни были найдены в качестве важного биомаркера прогрессирования для более чем 40 различных заболеваний человека, включая лисосомальные заболевания хранения, инфекционные заболевания, респираторные заболевания, эндокринологические заболевания, сердечно-сосудистые заболеваний, неврологических заболеваний и др. (обзор10). Во многих из этих заболеваний, уровни Chit1 являются сильным предиктором тяжести заболевания и терапевтической эффективности10.
Как хитиназа приобрели репутацию биомаркера для многочисленных заболеваний, включая болезнь Гоше, инструменты и анализы были разработаны для облегчения тестирования на наличие хитиназа. Более старые методы включают процедуру Schales, протокол приспособленный от испытания глюкозы крови, и метод 3.5 динитрозалиловной кислоты (DNS). Тем не менее, эти методы часто чувствительны к времени и технически трудно11. Процедура для обоих из этих испытаний требует уменьшения неорганических окислителей, ferricyanide в случае процедуры Schales например, производя изменение цвета которое можно только измерить спектрофотометрическо. Кроме того, оба теста включают нагревание или кипячение шаг, который является одновременно трудоемким и необходимым для цвета развиваться12,13.
Описано здесь быстрый и простой фторметрический анализ для определения уровня хитиназы в образцах млекопитающих14,15. Два из используемых здесь образцов включают сыворотку и бронхоальвеолярные лавовые жидкости (BAL); хитиназа активность также измеряется в грудном молоке и моче образцов, и техника может быть выполнена в этих типах образцов, а также в любой другой биологической жидкости16,17.

<table><tbody><tr><td>4-метилумбеллиферон</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Стандарт: обычно используется в флуориметрических анализах для определения активности фермента</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>флуоресцентный хитиназный субстрат для использования в образцах мышей</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>флуоресцентный хитиназный субстрат для использования в образцах человека</td></tr><tr><td>Лимонная кислота-моногидрат</td><td></td><td></td><td>для использования в McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td>для использования в стоп-буфере в концентрации 0,3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>для использования в McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>для использования в стоп-буфере в концентрации 12 г/л</td></tr><tr><td>Vision Plate: Нестерильный, необработанный черный 96 луночный планшет</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

Измерение активности читиназа в биологических образцах

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Читиназа являются ферментами, которые расщепляют хитин. Даже при отсутствии хитина млекопитающие имеют значительное количество хитиназах, присутствующих в организме, в том числе на исходном уровне. Точная роль хитиназа не известна, однако считалось, что она играет важную роль в пищеварении и защите организма от содержания хитина и патогенов, соответственно. Последние работы, в том числе наша, показали важную роль хитиназа и хитиназа, как белки в иммунитет хозяина и аллергических заболеваний. Важно отметить, что хитиназа деятельности служат важными биомаркерами тяжести заболевания в широком диапазоне заболеваний, включая тип 2 воспалительных заболеваний, таких как астма и легочный фиброз. Аналогичным образом, пациенты с генетическими расстройствами, как болезнь Гоше имеют значительно повышенный уровень хитиназа, которые не только коррелируют с тяжестью заболевания, но и служат надежным биомаркером для терапевтической эффективности. В описанном здесь протоколе описывается простой, быстрый и простой способ измерения активности хитиназы в образцах БАТ или сыворотки мышей и может быть широко адаптирован к человеческим субъектам и другим типообразуя организмам из-за высокосохранительной природы ферментов.

Результаты, показанные здесь, взяты из исследования, измеряя активность хитиназы в сыворотке крови и BAL образцах дикого типа (C57BL/6) и chit1 трансгенных мышей (на фоне C57BL/6), которые переэкспрессируют ген Chit1 на промоторизме доксициклина. Наши данные показывают, что оба образца сыворотки и БАЛ имеют обнаруживаемую активность хитиназы на базовом уровне 698,2 и 189,9 нмоль/моль и 485,7 и 114 нмоль/мл/х, соответственно. Переэкспрессия гена Chit1 с использованием доксициклина в питьевой воде в течение 4 недель привел...

Здесь представлен простой метод измерения активности хитиназы в биологических жидкостях, таких как бронхоальвеолярная лаваж или сыворотка.

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Этот метод позволяет более эффективный способ количественной оценки активности хитиназы в биологических образцах. Chitinase деятельности было показано, служить хорошим маркером для диагностики и терапевтической эффективности в многочисленных условиях и заболеваний. Более ранние методы измерения активности хитиназы часто ото дня и трудно выполнить, обе проблемы, которые были решены в результате анализа показано здесь.Этот метод поможет выполнить потенциальные хитины имеют в качестве диагностического и терапевтического маркера, сделав его легче измерить активность хитиназы; например, он может быть использован для мониторинга лечения болезни Гоше, потому что хитиназы активность, как было показано, уменьшается во время эффективного лечения. Начните с подготовки субстратов, стандартов и решений для анализа. Подготовь 1x mcIlvain буфер в соответствии с рукописными направлениями и использовать его для разбавления хитин субстратов до 500 микромолей каждый.Растворите 4-метилумбеллиферон, стандарт, до концентрации 0,1 миллимолара в стоп-буфере, чтобы создать стандартный раствор кривого запаса. Для каждых 10 образцов, смешайте 2.17 миллилитров буфера 1x McIlvain с 100 микролитров хитин субстрата для создания рабочего решения, а затем пипетки 95 микролитров рабочего решения в каждой колодец 96-хорошо пластины. Добавьте пять микролитров тестового образца к каждой хорошо и смешайте его в рабочем решении.Накройте пластину и встряхните ее в течение пяти секунд, затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы энзиматическая реакция состоялась. Между тем, разбавить фондовый раствор 4-метилумбеллиферон, чтобы сделать пятимимолярный рабочий стандартный раствор и создать стандартную кривую, подготовив серию разбавлений в соответствии с рукописью. Начните с пятимимолярной концентрации и хорошо перемешайте каждое разбавление.После инкубации добавьте 200 микролитров стоп-буфера к каждому колодец, чтобы остановить реакцию. Добавьте 300-микролитровые дубликаты каждого стандарта к одной и той же пластине, затем прочитайте пластину при возбуждении 360 нанометров и выбросе 455 нанометров. Этот протокол был успешно использован для измерения активности хитиназы в бронхоалвеолярной лаваж и сыворотки жидкости дикого типа и хитотриозидазы чрезмерного выражения трансгенных мышей.Анализ подтверждает, что переэкспрессия гена CHIT-1 у мышей приводит к повышенной активности хитиназы. Стандартная кривая использовалась для определения хитиназы на основе флуоресценции образцов. Самое главное помнить при первой попытке протокола, чтобы добавить образцы как можно быстрее и эффективнее, а еще тщательно смешивания.При первом запуске может быть полезно сделать меньше образцов за пробег, чтобы обеспечить точность измерений, из-за более короткого инкубационный период.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Мы описываем низкая стоимость, высокая пропускная способность метода для выявления грибковых деятельности в...

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Это видео демонстрирует анализ для скрининга ферментов, эффективных в разложении сложных полисахаридов в растительной биомассе с использованием нерастворимой хромогенной биомассы или ICB. Ферменты гидролизуют ICB с выделением растворимых олигосахаридов, связанных с красителем, а активность фермента оценивают путем колориметрического анализа продукта реакции.

Скрининг нерастворимых хромогенных ферментов на основе биомассы: анализ для оценки деградационной активности ферментов, разрушающих растительную биомассу

Это видео демонстрирует измерение in vitro активности фермента α-галактозидазы А и кислоты α-глюкозидазы в образцах с использованием синтетических субстратов 4-метилумбеллиферила.

Измерение in vitro активности фермента α-галактозидазы А и кислой α-глюкозидазы

Здесь мы представляем протоколы для быстрого скрининга и характеристики ферментов на антимикробную активность. В анализе диффузии микрослайдов и анализе высвобождения красителя используются целевые бактериальные субстраты для качественной и количественной оценки ферментативной активности.

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Описан высокопроизводительный анализ для скрининга ферментов. Этот мультиплексный готовый к использованию набор для анализа состоит из предварительно отобранных субстратов C,hromogenic P.olymer H,ydrogel (CPH) и сложных субстратов Inрастворимых C,hromogenic Biomass (ICB). Ферментами-мишенями являются полисахариды, разрушающие эндоферменты и протеазы.

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Мы описываем базовый протокол для количественной оценки активности АТФазы in vitro. Этот протокол может быть оптимизирован в зависимости от уровня активности и требований к данной очищенной АТФазе.

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; АТФазы для ферментативного определения характеристик

Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации chromatin о модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ДНК впоследствии используется для количественного PCR допросить изобилия и локализации столб-поступательные изменения гистона на протяжении всего генома.

Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae

Мы описываем модифицированный метод на основе агара, предназначенный для количественной оценки противогрибкового воздействия растительных продуктов. С помощью этого протокола можно оценить как летучий, так и нестабильный вклад в противогрибковую активность. Кроме того, эффективность против грибов может быть измерена на ключевых стадиях развития в одной экспериментальной установке.

Измерение летучих и нестациональных противогрибковых действий продуктов биоконтроля

В этом протоколе описан способ получения количественных данных о противогрибковой активности пептидов и других соединений, таких как низкомолекулярные противогрибковые средства, против Candida albicans. Использование оптической плотности, а не подсчета колониеобразующих единиц для количественной оценки ингибирования роста, экономит время и ресурсы.

Количественная оценка противогрибковой активности пептидов против Candida albicans

В данной работе представлены стандартизированные экотоксикологические методы оценки биомаркеров у неотропических видов бесхвостых. В частности, в данной статье подробно описаны несколько методологий на различных уровнях экотоксикологической оценки, таких как генетический, клеточно-гистологический, биохимический, морфологический и индивидуальный уровни.

Экотоксикологические методологии оценки биомаркеров в различных масштабах у неотропических бесхвостых

Узнайте упрощённый метод измерения активности хитиназы в биологических образцах, таких как бронхоальвеолярный лаваж и сыворотка. Этот подход помогает мониторить эффективность лечения болезни Гоше и других заболеваний.

Измерение активности читиназа в биологических образцах

Больше видео