Анализ функции спутниковых клеток во время регенерации скелетных мышц путем травма кардиотоксина и инъекций самодоставки siRNA In Vivo

Этот метод позволяет комбинирование внутримышечной инъекции сердечно-токсина змеиного яда, внутримышечной инъекции самопоставки siRNA, тем самым позволяя анализ регенерации скелетных мышц. Применение самопоставки siRNA является элегантным способом исследовать функциональную потерю отдельных генов во время регенерации мышц, тем самым избегая трансгенных животных. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ног, бритье области инъекций черепной нижней ноги от колена до лапы, и удалить любые свободные волосы.

Поместите мышь в состоянии лежа на заголовок площадку, покрытую стерильной хирургической тканью, и использовать 70% этанола для дезинфекции области инъекции черепной нижней ноги. Затем загрузите инсулиновый шприц, оснащенный иглой 29-го калибра, с 50 микролитров 20 микромолярный кардиотоксин и проткните кожу полностью в мышцу, просто дисталь к колену. Когда игла на месте, вводить кардиотоксин в течение 10-20-секундного периода доставки по всей длине мышцы, при перемещении иглы вперед и назад, чтобы обеспечить равномерное распределение кардиотоксина, тем самым ранив всю переднюю мышцу голени.

Затем верните мышь в клетку на грелке с мониторингом до полного лежачих времени. Через три дня после операции, дезинфицировать область инъекции, как только что продемонстрировали. Введать до 50 микролитров siRNA направлены против целевого гена интереса в голени передней мышцы обезболивающей мыши, как только что продемонстрировали.

Затем верните мышь в клетку, с контролем до полного лежачих. Перед сбором травмированной мышечной ткани, оберните фольгу вокруг карандаша и запечатать карандаш лентой, так что дно формы обеспечивает овеную, закрытую поверхность. Когда плесень будет готова, дезинфицировать все животное с 70% этанола, и использовать дополнительные острые ножницы, чтобы удалить кожу на лодыжке.

Перед сбором мышц, использовать тонкие щипцы, чтобы ущипнуть закрытые щипцы через фасции рядом с голени кости на лодыжке травмированной ноги, и переместить щипцы к колену, чтобы разорвать фасции, подвергая голени передней мышцы. Чтобы изолировать переднюю мышцу голени, разоблачить дистальное сухожилие, и захватить сухожилие с тонкой типсов. Используйте весенние ножницы, чтобы сократить сухожилия, и схватить мышцы сухожилия тянуть мышцы к колену.

Чтобы позволить анализ области среднего живота, используйте прямые ножницы, чтобы сократить tibialis передней мышцы в середине живота области на две половины одинакового размера, и заполнить карандаш плесень на полпути с замораживанием раствора. Вставьте две половинки передней мышцы голени в замораживание формы в вертикальном положении, с середины живота области, обращенной к нижней части формы. Используйте типсы для переноса замерзающей формы на полпути в жидкий азот.

Когда среда замерзания меняется от прозрачной к белой и становится твердой, перенесите замерзающую форму в морозильную камеру на 80 градусов по Цельсию или высушите лед для будущей обработки. В контрольных мышцах архитектура ткани остается нетронутой, о чем говорит локализация ядер на периферии миофиберов, а также отсутствие накопления мононуклеированных клеток в интерстициарных пространствах. Через семь дней после кардиотоксина опосредовано травмы, новые миофиберы образуются, как отмечены централизованно расположенных ядер, и накопление мононуклеированных клеток, состоящих в основном из спутниковых клеток, но и немиогенных клеток, таких как иммунные клетки.

В условиях покоя, спутниковые клетки, отмеченные Pax7 окрашивания в красный цвет, расположены под базальной ламины, показано зеленым здесь. Через три дня после травмы количество спутниковых ячеек увеличивается, и спутниковые клетки больше не находятся под базальной ламиной. На 10-й день после травмы количество спутников по-прежнему увеличивается.

Для дальнейшего анализа процесса регенерации, вновь сформированные миофиберы могут быть окрашены антителами, направленными против развития миозин. Через два дня после инъекции с siRNA, спутниковые клетки могут быть проанализированы на наличие флуоресцентно помечены siRNA. В этом репрезентативном эксперименте, около 75% спутниковых клеток в регенерирующей мышце были положительными для флуоресцентно помечены siRNA.

Кроме того, около 74% всех регенерирующих миофиберов были также положительными для флуоресцентно помечены siRNA, предполагая, что либо 74% регенерирующих миофиберов взял siRNA, что siRNA-положительные спутниковые клетки слились вместе, чтобы сформировать новые миофиберы, или что слияние с уже существующими регенерации myofibers произошло. Наиболее важным шагом является достижение полной травмы передней мышцы голени. В дополнение к гистологическому анализу, такие параметры, как генерируемая сила, могут быть записаны для функционального анализа регенерации скелетных мышц.