Определение отношений к само- и межповреждению в сочетании с абрикосом, комбинируя опыление рук, микроскопию и генетический анализ

Этот метод может помочь определить требования к опылению у различных видов и установить несовместимость отношений между сортами. Основным преимуществом такого подхода является то, что он позволяет оценить несколько несовместимости в лабораторных условиях. Как избежать многочисленных проблем, которые могут возникнуть в экспериментах, выполняемых в полевых условиях.

Это позволяет идентифицировать наряду с посвящением ряда сортов соответствующим группам несовместимости. Определение взаимосвязи между сортами совместимости. Этот подход также может быть полезен для определения взаимосвязи между самосовместимостью и несовместимостью в других культурах плодовых деревьев, таких как вишня или слива.

Начните с отбора проб цветов в поле. Соберите цветы на этапе воздушного шара, который соответствует этапу 58 по шкале BBCH для абрикоса, чтобы избежать предыдущего опыления. В лаборатории удалите пыльы цветов и поместите их на лист бумаги, чтобы высохнуть при комнатной температуре.

Через 24 часа сито пыльцы зерна с тонкой 26 миллиметровой сеткой. Emasculate группы из 30 цветов на той же стадии развития шара для каждого самоуправления и перекрестного опыления и место пистолеты на флорист пены в воде 24 часов после выхолощения и опылить пистолеты с помощью кисти с пыльцой из цветов того же сорта. Опылять другой набор пистолетов каждого сорта с пыльцой из цветов совместимого опылителя в качестве контроля.

Через 72 часа, удалить пистолеты из мокрой пены флориста и исправить пистолеты в фиксативном растворе 3:1 этанола уксусной кислоты, по крайней мере 24 часов при 4 градусах по Цельсию. Затем отбросьте фиксатор и добавьте 75% этанола, убедившись, что образцы полностью погружены в раствор. Образцы могут храниться в этаноле при 4 градусах цельсия до их использования.

Разбросать пыльцевые зерна тех же сортов, используемых для контроля опылений в затвердело пыльцы прорастания среды и наблюдать их под микроскопом после 24 часов. Подготовка пистолетов для микроскопии путем мытья их 3 раза с дистиллированной водой в течение одного часа за стирку. После последней стирки оставьте их в 5% сульфита натрия при 4 градусах по Цельсию в течение 24 часов.

Затем автоклав их на один килограмм сантиметра в квадрате в течение 10 минут в сульфите натрия, чтобы смягчить ткани. Поместите автоматические пистолеты на стеклянную горку и используйте скальпель, чтобы удалить трихомы вокруг яичника. Затем раздавить пистолет с крышкой.

Нанесите каплю анилинового синего цвета на препараты, чтобы испачкать мозкие отемки во время роста пыльцы и наблюдать за пыльцой трубок вдоль стиля с микроскопом в соответствии с рукописными указаниями. Используйте коммерческий комплект для извлечения геномной ДНК из молодых листьев, собранных весной. Затем на настройку ПЦР путем объединения реагентов в соответствии с рукописными указаниями.

Вихревая смесь реакции и распределение ее между скважинами в пластине ПЦР. Добавьте 1 микролитр разбавления ДНК в каждый колодец и запустите ПЦР с помощью термо-велосипедной программы, изложенной в рукописи. После завершения реакции проанализируйте результаты с помощью капиллярного электрофореза или электрофореза агарозного геля.

Для капиллярного электрофореза добавьте 1 микролитр продукта ПЦР в колодец плиты считывателя вместе с 1 каплей минерального масла для предотвращения испарения воды. Затем подготовьте разделительную пластину, добавив буфер разделения. Используйте коммерческое программное обеспечение для анализа генов, чтобы создать новую пластину образца и сохранить имена образцов для всех скважин на пластине.

Затем выберите метод анализа и вставьте две пластины в анализатор генов. Заполните капиллярный массив дистиллированной водой. Загрузите линейный полиакриламинидный гель и нажмите пробег.

При анализе результатов ПЦР с помощью гель-электрофорез, подготовить 1%agarose гель путем растворения агарозы в электрофорез работает буфер в соответствии с рукописными направлениями. Затем добавьте 4 микролитров пятна нуклеиновой кислоты в гель и аккуратно перемешайте. Настройка гель лоток с гребнем и замедление залить гель в середине заботясь, чтобы избежать пузырьков.

Оставьте гель при комнатной температуре до полного затвердеть, около 30-45 минут. Затем положить в камеру электрофорез. Снимите гребень и накройте его 1x буфером TAE.

Загрузите гель с помощью ДНК-лестницы, за которой последуют продукты ПЦР, смешанные с погрузочным красителем. Затем запустите гель на 90 вольт в течение 60-90 минут, пока синий краситель линия составляет примерно 75% от геля переулок. После завершения пробега визуализуйте гель с помощью трансиллюминатора.

Рост пыльцы трубки в само- и перекрестных опылений наблюдался с помощью флуоресценции микроскопии, чтобы определить себя (в)совместимость для каждого сорта. Культивары считались несовместимыми, когда рост пыльцы трубки был арестован и совместим, когда по крайней мере одна пыльца трубки достигли основания стиля. 5 комбинаций пары грунтовки были использованы для идентификации S-аллелей с использованием ПЦР в сочетании с капилляром или гель-электрофорезом.

Во-первых, S-аллели были определены по усилению первого S-RNase интрона с помощью пары SRc грунтовки. Затем второй интрон RNase был усилен тремя наборами грунтовки, чтобы различать аллели S6, S9, S1 и S7. И V2 и HVB переменных регионах гена SFB были усилены aprFBC8 грунтовки набор для выявления Sc и S8 аллели.

После того, как S-аллели были определены, различные группы несовместимости с генотипами, которые являются взаимо несовместимыми могут быть установлены. Важно помнить, чтобы использовать контроль в капиллярных электрофорез, так как они используют автоматическую систему анализа фрагментов, которые могут сообщить, как больше различий в размерах фрагментов вызывает неточную идентификацию аллелей. Сочетание наблюдений микроскопии и генетического анализа привело к очень полезному подходу к определению само несовместимости абрикоса и установлению несовместимости между сортами.

Самосовместимость в настоящее время является связующим звеном с местными жителями в абрикосе. Определение факторов, как представляется, связано с этим. Будущие усилия должны быть сосредоточены на генетическом назиданию этого сорта абрикоса.

Сочетание этого документального подхода приводит к получению ценной информации для соответствующего выбора сортов в коммерческих садах и генотипов в программах разведения абрикосов. Аналогичный подход может быть использован и в других древесных многолетних культур.