Внутритековая доставка антисмысловых олигонуклеотидов в центральной нервной системе Крысы

Этот протокол позволяет прямой доставки терапевтических средств в центральную нервную систему крысы для оценки фармакокинетики, фармакодинамики и эффективности новых терапевтических средств в моделях крысиных болезней. Эта процедура безопасна, эффективна и не требует дорогостоящего оборудования или хирургических инструментов. Демонстрацией процедуры будут И Чэнь и И Луо, ученые-исследователи из моей лаборатории.

Чтобы подготовить специальные направляющий канюли, используйте роторный инструмент с отрезанным колесом, чтобы отрезать оба конца 19 калибровочных игл, чтобы получить примерно полтора-два сантиметра направляющий канюли. Затем используйте шлифовальные колеса роторного инструмента, чтобы сгладить оба конца. Чтобы подготовить сборку катетерной проволоки, вырежьте один восьмиметровый кусок труб PE10 диаметром 011 дюймов, чтобы служить внутритекалийным катетером для каждого животного.

Используйте перо маркера, устойчивый к этанолу, чтобы сделать отметку в двух сантиметрах от одного конца каждого куска труб. Для каждого животного вставьте 11-сантиметровую проволоку, вырезанную из полиэтиленового покрытия из нержавеющей стали, в люмен восьмиметрового катетера PE10. Чтобы подготовить сборку катетера доставки, вырезать кусок от пяти до 10 сантиметров 023 дюйма диаметром PE50 катетер и вставить 23 калибровочных трубки адаптер в один конец катетера.

Затем вставьте 30 калибровочных игл с концентратором, отрезанной примерно на 0,5 сантиметра куском трубки PE10, и соедините трубки PE10 с другим концом катетера. Чтобы подготовить руководство канюлы иглы сборки, место руководство канюлы в конце 23 калибровочной иглы. Перед началом операции поместите грелку на хирургический стол и накройте площадку стерильным листом драпировки.

Поместите 50mL конической центрифуги трубки на лист и подтвердить отсутствие реакции на щипать в анестезировали экспериментальной крысы. После взвешивания животное, брить спину от хвоста до хвоста хвоста грудного отдела позвоночника и поместить бритую крысу на стерильный лист в положении склонны. Распоитите 50-метровую трубку под брюшком, чтобы сгибать позвоночник в поясничной области, и наносить офтальмологическую мазь на глаза.

Далее, подкожно ввести один миллиграмм на килограмм устойчивого выпуска Бупренорфин и очистить открытые кожи с последовательным povidone и спирта скрабы. Драпировать животное с фенестированный стерильный прозрачный лист. Для размещения катетера и инъекции соединения, определить две естественные ямы между мышцами выше бритого таза, и с одной стороны, держа ямы, использовать другую руку, чтобы мягко нажать и почувствовать позвоночник от хвоста до рострального направления, чтобы найти первый крупный отступ между позвонками.

После определения межпозвонкового пространства между позвонками S1 и L6, двигаться немного rostrally для выявления межпозвоночного пространства между L5 и L6 позвонков. Используйте скальпель, чтобы сделать не более двух сантиметров длиной разрез в коже и мышечной капсулы на этом сайте вдоль средней линии от рострального до хвостового направления, так что место инъекции будет в центре разреза. Используйте ножницы для вскрытия соединительной ткани до тех пор, пока мышечный слой не будет визуализирована.

Сделайте один сантиметровый разрез в мышечной капсуле сразу же боковой к спинному спинному процессу поясничного позвонка L6. Распорежите сборку иглы канюли рядом с передним аспектом шестого поясничного позвонка и нажмите сборку в межпозвонковое пространство вдоль переднего аспекта шестого позвонка так, чтобы конец иглы проникал в позвоночный канал. Используйте тупые типсы, чтобы найти спинной спинной процесс поясничного позвонка L6 затем нажмите иглу вдоль переднего аспекта шестого позвонка в инвертебрата пространстве.

Нажмите направляющий канюлю на место вдоль иглы, удалите иглу и вставьте сборку катетерной проволоки в направляющий канюлю. Angling катетер под углом примерно 45 градусов к спинномозговому каналу, заставить конец катетера примерно 0,3 сантиметра в канал. Удалите стилизованную проволоку примерно на 2,5 сантиметра от внутритекалиодней кончика катетера и заранее катетер в спинномозговой канал, пока два сантиметра маркировки на катетере просто видны ниже мышцы.

Когда катетер на месте, удалить направляющий канюли, чтобы оставить катетер и stylet провода на месте. Заранее катетер в спинномозговой канал, пока два сантиметра знак находится на входе в канал и полностью снять stylet провода. Церебральная спинномозговая жидкость может быть визуализирована при входе в имплантированный катетер.

Затем соедините сборку катетера доставки с дистальной концом имплантированного катетера через 30 калибровочный конец иглы. Затем загрузите 60 микролитров стерильного солевого раствора в 100 микролитровый шприц и загрузите болюс из 30 микролитров испытательного соединения во второй шприц. Подключите солевой шприц к тюбинговому адаптеру конца сборки катетера доставки и смойте 20 микролитров стерильного солевого раствора во внутриклеточное пространство.

Когда весь солевой раствор будет промыт, замените солевой шприц на заряженный болус шприцем и ввелите 30 микролитров испытательного соединения во внутритекалионные пространства в течение 30 секунд. Когда все болюс был доставлен, заменить болюс загружен шприц с другим солевым заряженным шприцем и промыть катетер с дополнительными 40 микролитров солевого раствора. Когда второй том солевого раствора был доставлен, отсоедините сборку катетера доставки от имплантированного катетера и используйте пару очень горячих теплостерилированных препарированных типсов, чтобы зажать трубку, чтобы асептически вырезать и тепло запечатать имплантированный катетер.

Используйте абсорбируемые монофильтрные швы для защиты теплозапечатаемого катетера к соединительной ткани, а затем используйте неабсорбируемые швы, чтобы закрыть кожу. Затем используйте марлю и солевой раствор, чтобы вымыть кровь из кожи и поместить крысу в нагретый инкубатор с мониторингом до полной компенсации. В этом репрезентативном эксперименте, очень хороший нокдаун был получен во всех регионах, собранных после одного болюс антисенсе олигонуклеотид доставки, как попродемонстрировано.

Тем не менее, некоторая степень региональной изменчивости была измерена с спинного мозга, проявлял самый высокий процент нокдауна. После успешной инъекции антизенсового олигонуклеотида или других терапевтических средств в соответствующую модель можно оценить фармакокинетику, фармакодинамику и эффективность терапии.