Обнаружение рака яичников с использованием фотоакустической цитометрии потока

Представлен протокол для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток яичников, используя специально сделанную фотоакустическую систему потока и целевые фолиевую кислоту, покрытые наночастицами сульфида меди.

Текущие клинические меры обнаружения рака яичников являются неспецифическими и отсутствие точки ухода обнаружения циркулирующих опухолевых клеток. Наша система фотоакустичных потоков позволяет тестировать образцы пациентов на специфические маркеры рака яичников в крови. Эта процедура обеспечивает уникальную технологию платформы с улучшениями по сравнению с современными методами с точки зрения простоты, низкой стоимости, перспективных пределов обнаружения и способности применяться к широкому применению.

Благодаря этой работе, мы стремимся построить от нашей целевой системы наночастиц для рака яичников для тестирования ex vivo образцов пациента для КТК. Эта универсальная система PAFC способна расширяться для клинического использования, проверяя наличие в крови широкого спектра биомаркеров. Надлежащее оптическое выравнивание имеет решающее значение для обнаружения целей в системе цитометрии фотоакустиического потока.

Кроме того, чтобы обеспечить правильное акустическое соединение, убедитесь, что между стеклянной горкой и предуцером нет пузырьков. Из-за обычая системы потока и ее компонентов, визуализация метода полезна для точного воспроизведения. В вентилируемом химическом дымовом капоте фильтруем около 300 миллилитров деионизированной воды через стерильный 0,2-метровый фильтр.

Добавьте 0,0134 грамма хлорида меди и 100 миллилитров деионизированной воды в чистую круглую нижнюю колбу на 250 миллилитров, чтобы создать раствор хлорида меди в миллимоляре. Добавьте 0,015 грамма фолиевой кислоты в колбу и используйте магнитный батончик для смешивания раствора в течение примерно пяти минут. Затем смешайте 0,024 грамма неагидрата сульфида натрия со 100 микролитров деионизированной воды.

Используйте пипетку из 200 микролитров, чтобы медленно добавлять этот раствор в реакционной смеси в течение примерно 10 секунд. Крышка реакционной сосуда. Поместите сосуд в масляную ванну, установленную до 90 градусов по Цельсию, и продолжайте помешивать.

Примерно через 15 минут или когда масляная ванна достигла температурного диапазона от 85 до 90 градусов по Цельсию, позвольте реакции продолжиться в течение дополнительного часа. Когда реакция завершена, удалить реакцию сосуда из масляной ванны и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут, прежде чем передать его в ледяную ванну. После того, как реакция охлаждается, настроить рН примерно до 10 с помощью одного молярного гидроксида натрия.

Добавить смесь в 30 килодальтон центрифугации колонки в 15 миллилитров партий и центрифуги на 3, 082 раза г в течение 15 минут, чтобы очистить реакцию смеси. Во-первых, смешать фолиевую кислоту ограничен меди сульфидных наночастиц при надлежащей концентрации в свежих средствах RPMI. Добавьте этот раствор наночастиц к каждой из подготовленных 24-хорошо пластины, которая содержит SK-OV-3 клеток при концентрации 400 микрограмм на миллилитр.

Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение двух часов. После этого трипсинизировать клетки с 0,5 миллилитров 0,25%трипсина и ЭДТА. Чтобы нейтрализовать трипсин, добавьте по крайней мере один миллилитр фолиевой кислоты без RPMI 1640 полного роста средств массовой информации и центрифуги клеток в 123 раза г в течение шести минут.

Чтобы вымыть клетки, удалите супернатант, повторно наполните клетки двумя миллилитровАМИ PBS и центрифугой по 123 раза г в течение шести минут. Повторите этот шаг мытья дважды, чтобы удалить любые неограниченные наночастицы. Затем повторное распределение клеток с одним-двумя миллилитров 2%Tween раствора в PBS.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и Трипан Блю. Разбавить клетки в растворе 2%Tween в PBS к выбранной концентрации для обнаружения. Используйте предоставленный трехмерный файл STL для 3D-печати бака потока с помощью термопластика ABS или пластика PLA.

После печати бака, очистить и собрать систему для использования. Поместите стеклянные крышки на один миллиметр на три миллиметра слот и один сантиметр отверстие в системе потока и тщательно печать с силиконом, чтобы предотвратить утечку. Далее, поместить капиллярную трубку в силиконовые трубки.

Вставьте трубки в камеру потока через сторону резервуара потока таким образом, чтобы стеклянная капиллярная трубка была прямо над и перед трехмиллиметровым слотом и отверстием в один сантиметр. Печать трубки с силиконом. Затем подключите предуцатор к ультразвуковому импульсиву и приемнику.

Увеличь сигнал с 59 децибел усиления. Подключите выход фильтра к многоцелевому перенастраиваемому осциллоскопу, оснащенном встроенным полем программируемого массива ворот. Соедините одну из трубок, импайтуя из камеры потока, к Т-соединению, которое соединено с двумя шприц-насосами на каждой ветке.

Заполните один из шприц насосов с воздухом, а другой насос с образцом для анализа. Установите насос, содержащий воздух, со скоростью потока 40 микролитров в минуту и установите насос, содержащий образец, со скоростью потока 20 микролитров в минуту. Затем подключите оставшуюся трубку, выключаемую из системы потока, к контейнеру 10%bleach, чтобы избавиться от ячеек после выхода из системы потока.

Поместите участок кварцевой капиллярной трубки в прямое соответствие с предуцом в поле зрения микроскопа, чтобы обеспечить тщательное размещение оптического волокна над образцом таким образом, чтобы он освещает всю ширину трубки. Облучить образец с помощью оптического волокна, ченнесягового диодно-накачанного твердого лазера, работающего на длине волны 1 053 нанометров. Используйте камеру, установленную под микроскопом, чтобы зафиксировать поток, стрельбу лазером и прохождение образцов через систему потока.

В этом исследовании, фотоакустичный поток цитометрии и целевой сульфид меди целевой агент используются для обнаружения яичников циркулирующих опухолевых клеток. Типичное изображение синтезированных наночастиц TEM показывает, что средний размер типичной наночастицы составляет примерно 8,6 нанометров. Горизонтальные и вертикальные диаметры каждой частицы затем измеряются перпендикулярно друг другу и далее усредоваются.

Средний гидродинамический диаметр этих частиц составляет 73,6 нанометров. Медные наночастицы сульфида имеют характерную кривую поглощения, которая простирается в ближнем инфракрасном диапазоне. Существует небольшой артефакт около 850 нанометров, что вызвано переключением лазеров на спектрофотометр.

Флуоресценция микроскопии изображения клеток, инкубированных флуоресцентно помечены наночастицы показывают, что поглощение наночастиц может быть визуализировано наличием флуоресценции по всей клетке. Клетки, не инкубированные наночастицами, не показывают флуоресцентного сигнала. Наличие этого флуоресцентного сигнала указывает на успешное поглощение частиц и их способность обнаруживаться в системе потока.

Примеры типичных сигналов сбора данных приведены здесь. Необработанные данные указывают на различия в сигнале между наночастицами помеченных клеток, PBS и фолиевой кислотой, ограниченной наночастицами сульфида меди. Используя пользовательский лабораторный вид и программное обеспечение MATLAB, реконструкция изображений состоит из положительных и отрицательных элементов управления в режиме реального времени и после приобретения соответственно.

Отдельные конвертеры впоследствии преобразуются в пиксельные значения и отображаются в качестве независимых столбцов. Явные различия в фотоакустичный сигнал происходят между PBS и фолиевой кислоты ограничен меди сульфидных наночастиц при концентрации 100 микрограмм на миллилитр. Во время этой процедуры крайне важно правильно выровнять ультразвуковой трансдуцер, микроскоп и волоконно-оптический в системе цитометрии фотоакустиического потока.

Подтвердите выравнивание системы, проверяя положительный и отрицательный контроль. Благодаря универсальности методов фотоакустической таргетинга и широкому спектру применений, возможных с использованием PAFC, этот метод прокладывает путь для переводно важных клинических и исследовательских применений. Для обеспечения клинического применения, дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на тестировании образцов пациентов и сокращении процедурных шагов.

Синтез наночастиц должен происходить в химическом дымовом капюшоне с использованием надлежащего защитного оборудования. Линии клеток человека должны обрабатываться в соответствии с руководящими принципами вашего учреждения. Использование лазера требует обучения радиационной безопасности и соответствующего СИЗ.

Лазерное использование и фотоакустиическое тестирование должны проводиться только высококвалифицированным персоналом.