Изображение и анализ ориентации тканей и динамики роста в развивающихся дрозофилы Эпителия во время Pupal Этапы
2 июня 2020 г.
Этот протокол предназначен для визуализации и анализа динамики клеточной ориентации и роста тканей в эпидемии брюшной полости Drosophila, поскольку плодовая муха подвергается метаморфозе. Описанная здесь методология может быть применена к изучению различных стадий развития, тканей и субклеточных структур в дрозофиле или других модельных организмах.
В многоклеточных организмах ткани еще больше демонстрируют высокую степень пространственной ориентации. Клетки выравнивают и отображают диапазон приоритетов на больших расстояниях в течение морфогенеза. Чтобы понять, как планарные механизмы эпителии достигнут во время развития, очень важно отслеживать ориентации клеток и динамику роста с высоким пространствевой временной верности виво.
Описанный протокол предназначен для изображения и анализа поведения клеток на глобальном и местном уровнях в дрозофиле пупка эпидермиса. Эта методология может дать представление о различных теориях исследований, клеточной биологии, морфогенеза и планарной полярности и может быть применена к анализу других тканей, структур и моделей. Все шаги могут быть выполнены легко после некоторой практики.
Они требуют точности. Визуализация этого протокола помогает достичь оптимальных результатов в более короткие сроки. Рассечение щенков является сложным.
Для начала используйте увлажненный кисть, чтобы перенести постановочные белые предварительно куколки в свежий пластиковый флакон, и держать их там до тех пор, как это необходимо при 25 градусов по Цельсию. Затем удалите каждую куколку со стенки флакона с помощью типсов. Клей брюшной стороне каждой куколки на стеклянной слайд, покрытый двусторонним липкой лентой.
Аккуратно нажмите на голову spiracles и спинной поверхности куколки с кончиками типсов, чтобы обеспечить адгезию куколки случае ленты. Начните рассечение под стерео микроскопом, аккуратно удалив оперкулум из пупариума с помощью типсов. Вставьте один кончик типса на мелководье между корпусом куколки и поверхностью куколки через оперкулярное отверстие.
Разорвать случае с головы до хвоста боковой в одном или несколько качелей, избегая щипать куколку. Сложите обратно трещины куколки случае боковых сторон, как вы продолжаете приступить к задней части. Удалите куколку из открытого кукольного корпуса, тщательно вставив типсы под животное и аккуратно потянув вверх.
Куколка прилипает к кончику типса. Держите куколку осторожно на брюшной стороне, и передать куколку в стеклянное дно блюдо на вершине небольшой капли газоназного галоуглеродного масла. Ролл кусок мокрой бумаги ткани по краям блюдо и покрыть блюдо для поддержания влажности.
Ориентируйте куколку на каплю масла на стеклянные блюда с дном в зависимости от домена и процесса, который необходимо оценить. Для долгосрочной живой визуализации раннего расширения спинных гнезд, спинной боковой ориентации куколки. Чтобы изображение их позднего расширения и ткани ремоделирования, dorsally ориентировать куколку.
Перенесите стеклянную дном тарелку, содержащую установленные куколки, на стадию микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности брюшной полости с помощью передаваемого света. Чтобы использовать митотические рекомбинации, чтобы вызвать генетические мозаики в брюшной эпителия, подготовить девственных женщин проведения теплового шока неизгладимый flipase, FRT сайт в определенном геномном месте, и узнаваемый клеточный маркер дистал к FRT сайте. Подготовь самцов-мутантов, несущих FRT-сайт в эквивалентном геномном месте.
Крест несколько женщин и мужчин в три к одному пропорции в пластиковый флакон при 25 градусов по Цельсию в течение четырех-пяти дней. Для генерации соматических клонов в гистобластах, выполните обработку теплового удара на третьей стадии личинки звезды потомства креста, погружая пластиковые флаконы, содержащие животных в водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут до часа. В программном обеспечении изображения J используйте функцию проекции максимальной интенсивности для защиты срезов стеков, приобретенных с помощью конфоканной микроскопии в 2D.
Гнезда имеют характерную форму, которая ориентирует их в систему планарных координат передней слева и спинной к вершине. Для достижения оптимальных результатов с помощью этого анализа входное изображение должно быть получено с высоким разрешением. Чтобы получить качественные значения ориентации на локальных краях ячеек, нажмите на меню плагина и выберите вариант распределения ориентации J.
Установите сигму окна Гауссиана до одного пикселя, кубический сплайн к градиенту, минимальную согласованность до 20 процентов и минимальную энергию до одного процента. Иеготовите опцию цветового обследования плагина. Установите оттенок ориентации, насыщенности согласованности и яркости для ввода изображения.
Этот цвет кодирует ориентации края ячейки относительно установленной системы планарных координат. Далее, в меню плагина, используйте опцию измерения ориентации J для количественной оценки клеточной ориентации и направленной ячейки к выравниванию клеток. Создать небольшие, прилегающие неперекрывающиеся области, представляющие интерес для равномерного веса около 20 микрометров раз 20 микрометров в пределах площади, занимаемой гистобластов.
Мера нажатия вычисляет доминирующую местную ориентацию и согласованность от ROIs. В этом исследовании используемая методология способна генерировать фильмы с высоким разрешением развивающихся куколок в течение периодов до 48 часов без значительного отбеливания фотографий или фототоксичности. Примеры клонов дикого типа, отмеченные отсутствием RFP NLS и их двойных пятен через 26 часов после образования пупариума, показаны здесь.
Клоны удлинены вдоль сегментальных границ. Двойные клоны расположены параллельно или в тандеме. Морфология клона дикого типа через 26 часов и 47 часов после образования пупариума показывает сложную морфологию границ на обоих стадиях.
Участки коробки и усов для геометрических параметров через 26 часов и 47 часов после образования пупария показывают, что усредненные площади и периметр значительно увеличились в это время окна. Ориентация клона была поддержана во время расширения и реконструкции. Параметры формы через 26 часов и 47 часов после образования пупария указывают на шероховатости, округость и круговорот, практически не меняемые в клонах дикого типа.
Будьте уверены, чтобы не повредить куколку, в противном случае он умрет в течение нескольких часов, влияющих живой изображения. Этот протокол не требует использовать реагент сарта или инструмент. Избегайте щипать себя при вскрытии.
Применяя эти методологии можно генерировать фильмы с высоким разрешением в течение длительных периодов времени с использованием различных методов представить. Фокус для фотона или вращающихся дисков. Хлоральный анализ может быть использован для изучения неавтономных реакций, поскольку случайные клетки облегчают идентификацию перекрестных переговоров или механизмов сотовой связи.
Эти методы могут быть легко адаптированы для изучения полного спектра морфогенетических явлений, включая координацию эпидермального, мышечного и нейроразвития во время метаморфоз.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол разработан для визуализации и анализа динамики ориентации клеток и роста тканей в брюшном эпителии Drosophila в период метаморфоза у плодовой мушки. Методология, описанная здесь, может быть применена для исследования различных стадий развития, тканей и субклеточных структур у Drosophila или других модельных организмов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Морфогенез
- Планарная полярность
Фон
- Ткань демонстрирует высокую степень пространственной ориентации внутри многоклеточных организмов.
- Клетки выравниваются и проявляют приоритет на больших расстояниях в процессе морфогенеза.
- Отслеживание ориентации клеток и динамики роста важно для понимания эпителиальных расположений.
- Это исследование фокусируется на кукольной эпидерме Drosophila.
Цель исследования
- Визуализировать и анализировать поведение клеток на глобальном и локальном уровнях.
- Предоставить представление о теориях клеточной биологии и морфогенеза.
- Применить методологию к различным тканям и модельным организмам.
Использованные методы
- Методы визуализации для отслеживания ориентации клеток.
- Анализ динамики роста тканей.
- Ин-виво наблюдение за развитием Drosophila.
- Применение протокола к различным стадиям развития.
Основные результаты
- Высокая пространственно-временная точность в отслеживании поведения клеток.
- Представление о динамике ориентации клеток в период метаморфоза.
- Потенциальные применения для других тканей и модельных организмов.
- Методология доступна после практики.
Выводы
- Протокол улучшает понимание эпителиального морфогенеза.
- Он может быть адаптирован для различных исследовательских приложений в клеточной биологии.
- Будущие исследования могут использовать эту методологию для получения более широких знаний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
