Сравнение метастатической ясной клеточной почечной карциномы модели, созданной в мышиной почки и на куриные хориоаллантоический Membrane
8 февраля 2020 г.
Метастатическая ясная клеточная карцинома является заболеванием без комплексной модели животных для тщательного доклинического исследования. Этот протокол иллюстрирует две новые модели животных для болезни: ортотопически имплантированной мыши модели и курица хориоаллантоической мембранной модели, оба из которых демонстрируют метастазирование легких, напоминающие клинические случаи.
Чистая клеточная почечная клеточная карцинома или CCRCC, является наиболее распространенным подтипом рака почек. Локализация CCRCC имеет благоприятный исход с хирургией. Тем не менее, одна треть пациентов CCRCC будет развиваться отдаленные метастазы в легкие.
Что приводит к очень плохому исходу для пациентов. К сожалению, никакой терапии для этой смертельной стадии не существует. Поскольку молекулярный механизм метастазирования остается арусивным.
Цель этого протокола заключается в внедрении и сравнении двух моделей животных, недавно созданных для метастатических CCRCC. Первая модель – это мышь для имплантации темы. В этой модели мыши, неоднородный CCRCC имплантируется в почечную капсулу мыши.
Рост опухоли и метастазы являются активом через 10 недель. Второй моделью является модель куриной хориоалантоической мембраны, или модель CAM. В этой куриной модели в яйцо имплантируется неоднородный CCRCC.
Рост опухоли и циркулирующие опухолевые клетки являются активом после 10 дней имплантации до вылупления эмбриона. Метастазы легких являются активом после 24 дней имплантации. Это через две недели после вылупления.
Эти две новые модели будут полезны для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазирования в CCRCC. Обратите внимание, что процедура CAM не показана в этом видео. Подробный протокол для модели CAM описан и снят в другой статье Trove Шарроу и др.
После анестезии мыши, дезинфицировать заднюю часть мыши полностью с povidone-йод в течение трех раз. Следуйте 70%ethnol один раз, и протрите его сухим стерильными ватными тампонами. Затем нанесите три стерильные медицинские повязки последовательно покрытие всей спины для того, чтобы создать хирургическое поле, а также обездвижить мышь.
Перед операцией операторы должны дезинфицировать пальцы повидоне-йодом. Поместите мышь в положение, подверженную. И, используйте пальцы, чтобы найти левую почку прямо под левым флангом.
Используйте пару тупых типсов и ножниц, чтобы разрезать кожу и мышечный слой под указанным местоположением. Используйте стерильные ватные тампоны и миппы, чтобы частично аутентизировать левую почку из брюшной полости. Загрузите либо инсулиновый шприц, либо индивидуальный шприц Гамильтона с подвеской опухолевых клеток, приготовленной отдельно.
Введать 20 микролитров клеточной суспензии под капсулой почек. Медленно вытяните иглу для того, чтобы укрепить дополнительный клеточный матричный раствор. А также для предотвращения кровоизлияния или утечки опухолевых клеток.
А потом, использовать стерильный ватный тампон, чтобы подтолкнуть почку обратно в живот. Используйте шов, чтобы сшить мышечный слой. Дезинфицировать кожу повидоне-йодом.
И, закройте кожу с раны авто-клипы. Ортопедические укладки посадил опухолевые клетки успешно вырос на мышах почки, как подтверждено BLI. Хотя не было никакой разницы в первичном росте, только неоднородная метастатическая опухоль имела надежные метастазы в легкие.
Метастазы также были подтверждены иммуногистохимией. Аналогичным образом, количество циркулирующих опухолевых клеток было выше у мышей, несущих метастатическую опухоль, чем у тех, у кого нестатическая опухоль. При согласии с моделью мыши модель CAM также не показала разницы в росте между метастатическими и немастастатическими опухолями.
С другой стороны, количество циркулирующих опухолевых клеток было значительно выше в яйцах с метастатическими опухолями. Гистологологически обнаруживаемые метастазы наблюдались в легких вылупившихся кур. В заключение, этот протокол проиллюстрировал две новые модели животных для метастатических CCRCC.
И мышь, и курица модели точно recapitulated метастазы легких наблюдается в клинике. Эти две доклинические модели будут полезны для расширения понимания молекулярного механизма метастазирования. А также открыть для себя новые методы лечения метастатических CCRCC.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены две новые модели животных для изучения метастатического светлоклеточного почечноклеточного рака (СПКР), созданные для восполнения дефицита комплексных моделей для доклинических исследований. Эти модели включают модель с ортотопической имплантацией у мышей и модель на хориоаллантоической оболочке куриного эмбриона; в обоих случаях наблюдается метастазирование в легкие, аналогичное клиническим случаям.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Животные модели
- Исследование метастазирования
Теоретическая часть
- Светлоклеточный почечно-клеточный рак (СКПКР) является наиболее распространенным подтипом рака почки.
- Локализованный СКПКР имеет благоприятный прогноз при хирургическом лечении.
- У трети пациентов с СКПКР развиваются отдаленные метастазы, в частности в легкие.
- В настоящее время эффективной терапии для этой поздней стадии заболевания не существует.
Цель исследования
- Разработать и валидировать новые модели на животных для изучения метастазирования CCRCC.
- Облегчить проведение доклинических исследований механизмов заболевания.
- Улучшить понимание процессов метастазирования CCRCC в легкие.
Используемые методы
- Ортотопическая имплантация опухолевых клеток мышам.
- Использование модели куриного хориоаллантоиса.
- Наблюдение за развитием метастазов в легких в обеих моделях.
- Сравнение результатов моделирования с клиническими случаями.
Основные результаты
- В обеих моделях на животных был успешно продемонстрирован метастаз в легкие.
- Данные модели тесно соответствуют клиническим случаям прозрачноклеточного почечно-клеточного рака (CCRCC).
- Эти модели предоставляют платформу для дальнейшего исследования терапевтических стратегий.
- Были получены сведения о молекулярных механизмах метастазирования.
Выводы
- Разработанные модели представляют ценность для доклинических исследований CCRCC.
- Они расширяют понимание метастатических процессов при раке почки.
- Будущие исследования могут использовать данные модели для изучения потенциальных методов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метастатический светлоклеточный почечноклеточный рак (сКПКР) остается серьезной проблемой из-за отсутствия эффективных методов терапии и недостаточного понимания механизмов метастазирования. Описанные ортотопическая модель на мышах и модель на хориоаллантоической оболочке (ХАО) куриного эмбриона представляют собой взаимодополняющие доклинические системы для изучения метастазов в легких, позволяющие проводить валидацию мишеней и снижать механистические риски в процессе разработки новых препаратов. Эти модели повышают прогностическую достоверность при разработке терапии, воспроизводя клинические паттерны метастазирования на иммунокомпетентных и экономически эффективных платформах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать туморигенность и метастатический потенциал в гетерогенных популяциях кРКН, обусловленный потерей VHL.
- Практическая ценность: ортотопическая имплантация иммунокомпетентным мышам сохраняет взаимодействия между опухолью и стромой, которые имеют решающее значение для валидации мишеней.
- Научная ценность: облегчает функциональную валидацию генов и путей, связанных с метастазированием, с помощью тестов на колонизацию легких in vivo.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о числе циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в качестве фармакодинамического показателя при скрининге соединений.
- Практическая ценность: модель на курином эмбриональном хориоаллантоическом мембране (КАМ) обеспечивает быстрый и экономичный рост опухоли (10 дней) для стандартизации высокопроизводительных анализов.
- Научная ценность: позволяет оценивать интравазацию путем детектирования ЦОК как в моделях на мышах, так и в системах КАМ, что дает возможность проводить оценку соединений на ранних этапах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Модели воспроизводят клинический метастаз в легкие, обеспечивая создание релевантных систем заболевания для поиска и валидации биомаркеров.
- Практическая ценность: Расширенная модель CAM у вылупившихся цыплят (24 дня) позволяет выявлять микрометастазы с помощью иммуногистохимического анализа для проведения лонгитюдных исследований.
- Научная ценность: Способствует созданию ксенографтов из опухолевых тканей пациентов (PDX) из гетерогенных популяций опухолей для обеспечения преемственности в доклинических исследованиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данные модели интегрированы на разных этапах разработки: ортотопические мышиные модели используются для проверки гипотез и валидации сигнальных путей на ранних стадиях поиска, в то время как модель CAM (хориоаллантоическая мембрана) позволяет быстро разрабатывать методы анализа и подготавливать систему к скринингу. Обе системы обеспечивают получение количественных данных, таких как объем опухолевой массы, уровни CTC и количественная оценка метастатических очагов, что служит основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшего продолжения исследований. Модели выступают в качестве многократно используемых платформ для снижения рисков при выборе мишени и согласования трансляционных биомаркеров, что уменьшает биологический риск на этапе идентификации перспективных соединений.
- Биология открытий: проверка терапевтических мишеней путем оценки роста опухоли и метастазирования в легкие у иммунокомпетентных животных.
- Скрининг: предоставление стандартизированных, воспроизводимых систем для фармакодинамического мониторинга на основе CTC в рамках кампаний по скринингу соединений.
- Аналитика: возможность количественного сравнения метастатической нагрузки с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) и иммуногистохимического (IHC) анализа.
- Трансляционные исследования: связь этапа открытия с доклинической валидацией с использованием гетерогенных опухолевых моделей, совместимых с PDX.
- Корпоративное повторное использование: создание масштабируемой кроссплатформенной возможности генерации моделей метастазирования для различных терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях метастазирования за счет предоставления клинически релевантных моделей метастазов в легких.
- Операционная ценность: Модель CAM сокращает временные, трудовые и финансовые затраты по сравнению с традиционными моделями на мышах, обеспечивая при этом стабильное формирование опухоли и интравазацию.
- Стратегическая ценность: Улучшает отбор препаратов в портфеле, позволяя на ранних этапах оценивать метастатический потенциал и терапевтическую эффективность.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продвижении проектов с учетом рисков благодаря количественным конечным точкам метастазирования при доклинической валидации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области ортотопических хирургических методик и подготовки опухолевых клеток для имплантации в мышиные модели.
- Необходимо наличие стерильной хирургической инфраструктуры и протоколов анестезии для процедур на грызунах.
- Требуется доступ к эмбриональным яйцам и инкубационному оборудованию для реализации модели CAM.
- Необходима стандартизация подготовки суспензии опухолевых клеток и объемов инъекций (20 µL) для всех моделей.
- Метод опирается на гистопатологическую валидацию с помощью BLI и IHC для обнаружения метастазов, что требует наличия ресурсов для визуализации и патоморфологического анализа.
