Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования

Этот метод позволяет объективно каптуризации экспрессии генов микроглии на одноклеточном уровне, что может помочь выяснить молекулярную неоднородность микроглии в здоровом и больном мозге. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает детальную процедуру быстрой изоляции микроглии от различных областей мозга и показывает, как эффективно генерировать игровой базой одноклеточные библиотеки RA6 для глубокого секвенирования. Для начала этой процедуры подготовьте все необходимые буферы и решения, изложенные в текстовом протоколе, и охладите их на льду.

После усыпания и обезглавливания мыши, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать кожу на голове, чтобы разоблачить череп под ним. Затем прорезать сагиттаальный шов, овсяный шов и корональный шов. Используйте типсы, чтобы снять обе стороны теменной кости и межпариетальной кости, не повреждая ткани и осторожно переместить мозг в вскрытие чашки Петри, содержащей средний A.Using предварительно охлажденного лезвия, сократить мозг через середину на два полушария.

Используйте 55 типсов, чтобы отделить мозжечок от корковой доли и ствола мозга. Затем используйте 55 типсов, чтобы тщательно вскрыть гиппокамп и стриатум из коры и перенести каждую ткань в отдельную коллекцию чашки Петри. Во-первых, используйте лезвие бритвы, чтобы нарезать каждую область мозга на мелкие кусочки, которые меньше, чем один кубический миллиметр.

Используя одноми миллилитровую пипетку с отрезанным кончиком, перенесите кусочки ткани в предварительно охлажденные гомогенизаторы Dounce. Гомогенизировать ткани, медленно скручивания поршня в и из Dounce гомогенизатора в течение шести до 10 полных ударов, пока не видимые куски присутствуют. Затем перенесите диссоциированные ткани в 50 миллилитровых трубок через 70 микрометровых ситечкой.

Промыть каждый Dounce гомогенизатор и поршень в общей сложности шесть миллилитров холодной среды, а затем передать полоскания в 15 миллилитров трубки для центрифугации. Центрифуга одноклеточной подвески при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут с перерывом в пять. Промыть один большой столбец истощения и три больших столбца выбора в магнитном сепараторе с тремя миллилитров MCS.

Когда центрифугация образцов тканей завершена, пипетка и отказаться от супернатанта, не нарушая гранулы. Повторное использование клеток в буфере MCS, который содержит ингибитор RNase. Добавьте 100 микролитров шариков удаления миелина в каждую трубку, содержащую повторно приостановленные клетки из коры и мозжечка, и добавьте 50 микролитров бусинок удаления миелина в каждую из трубок, содержащих повторно приостановленные клетки из гиппокампа и стриатума.

Инкубировать трубки на льду в течение 10 минут. После этого добавьте MCS в трубку, содержащую корковые клетки, чтобы довести его объем до двух миллилитров и до остальных трубок, чтобы довести каждый из их объемов до одного миллилитра. После того, как столбцы пусты для полоскания буфера, загрузите два миллилитров корковых ячеек на большой столбец истощения и один миллилитр друг друга подвески ячейки на отдельные большие столбцы отбора.

Затем вымойте большие столбцы истощения одним миллилитром буфера MCS и помойте каждый большой столбец выделения дважды, используя один миллилитр буфера MCS для каждой стирки. Фильтр клетки через 35 микролитер ситечко шапки в круглое дно FACS труб. Центрифуга эти трубки в 400 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.

Затем медленно вылейте супернатант и мазок края трубки на бумаге ткани. Перепродюсовать клетки в каждой трубке с 300 микролитров буфера FACS. Во-первых, добавьте пять микролитров рецепторов мыши FC блок реагент для каждой трубки.

Инкубировать на льду в течение пяти минут. Затем добавьте один микролитер cd45 PE размером семь и один микролитер CD11B BV421 к каждой трубке. Инкубировать трубки на шейкер при комнатной температуре в течение 10 минут.

После этого добавьте два миллилитров буфера FACS для мытья. Центрифуга при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Повторное использование клеток в каждой трубке с 400 микролитров буфера FACS, содержащих один микролитер ингибитора RNase и 0,5 микролитров пропидия йодида.

Следуя стандартной процедуре FACS, сортируют одну живую микроглию со 100-метровым соплом в 96-колодец ПЦР пластин, которые содержат четыре микролитера буфера лиза в каждой колодец. Кратко вихрь пластин и спина их вниз с помощью скамейки верхней центрифуги. Храните тарелки при температуре минус 80 градусов по Цельсию до подготовки библиотеки.

Когда вы будете готовы к работе, разморозьйте плиту на льду. Используйте тепловой циклер для выполнения первой транскрипции для генерации кДНК и усиления кДНК с дополнительным шагом пищеварения экзонуклеазы, как указано в текстовом протоколе. После этого очистите cDNA, добавив 18 микролитров магнитных бусин к каждой хорошо.

Инкубировать пластину на магнитной подстоять в течение пяти минут. Затем снимите супернатант и мыть образцы дважды с свежеприготовленным 80%этанола с использованием 80 микролитров этанола на колодец для каждой стирки. Для выполнения тегментации используйте нанолитровую трубочную машину для смешивания 0,4 микролитров каждого образца cDNA с 1,2 микролитров реагентов Tn5 tagmentation из комплекта подготовки библиотеки в пластине 384-колодец при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Чтобы остановить реакцию тегментации, добавьте 0,4 микролитера буфера нейтрализации при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее, на 384 индексах и 1,2 микролитерах ПЦР смешиваются с образцами и усиливают библиотеки, как указано в текстовом протоколе. Объединить все отдельные библиотеки из той же пластины 384 хорошо вместе и использовать магнитные бусы для очистки окончательных объединенных библиотек.

В этом исследовании, микроглии изолированы от коры головного мозга, мозжечка, гиппокампа и стриатума полушария мозга взрослой мыши. Подготовленная клеточная подвеска изучается под микроскопом с помощью трипан-голубого и гемоцитометра для оценки урожайности, жизнеспособности клеток и эффективности удаления миелина перед выполнением окрашивания антител. Общее количество клеток на данный момент должно быть более 30 000 для коры и более 5000 для других тканей.

Более 90% клеток должны быть жизнеспособными с небольшим количеством мусора миелина. FacS машина используется для сортировки микроглии, которые, как правило, CD45 низким и CD11B положительным. Успешная изоляция должна генерировать более 80%микроглии из всех живых однок клеток, по крайней мере для корковых тканей.

После того, как отдельные микроглии захвачены в буфер лиза, РНК высвобождается, а затем обратно транскрибируется в cDNA, который затем усиливается в течение 23 циклов. Как капиллярная электрофорезная платформа, анализатор фрагментов и высокочувствительные наборы фрагментов NGS обеспечивают быструю и точную информацию о распределении размеров, а также количество молекул cDNA, присутствующих в каждом колодец 96-хорошо пластины. Образцы, показывающие мазок между 500 и 5000 базовых пар и выше определенного порога концентрации могут быть использованы для библиотек.

Образцы секвенированы на глубину более одного миллиона необработанных считывания на клетку, что насыщает способность обнаружения одноклеточной методологии секвенирования РНК. С картографической скоростью около 60%над 2, 000 генов могут быть обнаружены на микроглиальные клетки. Ранее опубликованные данные, полученные из этого метода изоляции, воспроизводятся в результате независимых экспериментов, демонстрируя чувствительность к обнаружению микроглии конкретных генов в последовательной популяции.

С информацией одиночных транскрипций микроглии, исследователя могут открыть уникально населенности клетки в смысле их интереса, и более далее изучить функциональную релевантность этих нов выявленных населенностей.