Ткань-инженерный трансплантат для обрезанной реконструкции пищевода у крыс

Обходной ремонт пищевода является технически сложной задачей в крысиной модели, что требует развития тканей инженерии пищевода, что позволяет регенерации слизистой оболочки пищевода и мышц без утечки анастомоза пищевода. В качестве экспериментальной модели мы внедрили двухслойную трубчатую эшафот, состоящую из внутренней нановофибры и внешней нити 3D-печати в сочетании с микрососудистым ингастомозом, чтобы свести к минимуму утечку слюны после трансплантации. Обычная стандартная реконструкция пищевода связана с широким спектром осложнений и заболеваемости.

Таким образом, инженерия пищеводных тканей может быть перспективной альтернативной стратегией для разработки местных моделей пищевода пациента. Сочетание гибридных эшафотов, выращивания биореакторов и системы перорального питания может быть применено к любой системе, которая имеет аналогичную загрязненную окружающую среду с ее непрерывным механическим давлением. Начните с стерилизации 3D-печатного эшафота пищевода с часовым воздействием ультрафиолетового света, 10-минутным замачиваемым этанолом и тремя стирками с ПОМОЩЬю PBS.

После последнего мытья, поместите двухслойный трубчатый эшафот в неадхерный 24-хорошо ткани культуры пластины, и мягко, но равномерно добавить один раз 10 до шести жиров полученных человеческих мезенхимальных стволовых клеток на миллилитр мембранной матрицы подвала дополняется роста среды внутренней поверхности эшафота. Используйте систему биореактора пульсирующего потока, чтобы прочно зафиксировать клеточный трубчатый эшафот к акриловой держатель в культурной камере биореактора, и добавить 500 миллилитров среднего роста в камеру. Затем нанесите 1 дина на сантиметр в квадрате вызванного потоком стресса стрижки во влажной атмосфере, содержащей 5%углекислый газ.

Через пять дней используйте набор анализа жизнеспособности LIVE/DEAD для определения реакций клеток на внутренней поверхности эшафота в соответствии со стандартными протоколами и изображения клеток с помощью конфокальные микроскопии. Перед началом хирургической процедуры подтвердите отсутствие реакции на педаль рефлекса у обезболивающей крысы и поместите животное в положение на спине на стерильную драпировку. Используйте клиперы, чтобы удалить волосы из хирургического участка, и дезинфицировать кожу с последовательными БЕТАДИН и 70%этанол скрабы.

Для размещения Т-трубки, сделать средней линии кожи и мышечного разреза в брюшной полости крысы, и использовать скальпель лезвие для создания трехмиллиметрового отверстия в передней стенке желудка. Вставьте кончик силиконовой Т-трубки в место дефекта, чтобы зафиксировать его на стенке желудка, и тщательно шов трубки желудочной мышечной ткани. Шов брюшной стенки с 4-0 VICRYL шов.

Тщательно вставьте дистальный конец имплантированного Т-трубки через подкожный туннель в задней части шеи, и использовать ангиокатетер для подключения гепарин крышка к концу Т-трубки, чтобы предотвратить содержимое желудка течет назад. Когда крышка на месте, используйте 4-0 полиглактина швы, чтобы закрыть все слои брюшной кожи, и поместите крысу в метаболическую клетку с мониторингом до полного устоя. Через неделю после размещения Т-трубки, подготовить крысу к операции, как попродемонстрировано.

Поместите крысу под микроскоп, и сделать передний средний разрез шеи в подвергаются дезинфекции кожи. Отделить мышцы ремня, чтобы разоблачить трахеозофагеальной структуры. Изолировать левую сторону пищевода от трахеи.

Тщательно отделить верхнюю часть пищевода от щитовидной железы, и использовать хирургические ножницы, чтобы создать пять миллиметров длиной полный окружной дефект, содержащий все слои пищевода. Далее вставьте 9-0 шва между правым inferoposterior края верхнего пищевода остатка и эшафот, и продолжать засовывать справа налево между верхней остатки пищевода и эшафот для создания микроанастомиза на верхнем конце дистального порока пищевода. Затем анатомозы эшафот таким же образом, как верхний предел нижней пищевода остатка.

Когда анастомы будут завершены, положите окружающий лоскут щитовидной железы над пересаженной площадкой, чтобы обеспечить сосудистое снабжение и стабильное поддержание трансплантата. Затем сшить подкожные мышцы и ткани кожи с 4-0 VICRYL шов, и поместите крысу в метаболической клетке на инфракрасном устройстве потепления с мониторингом до полного лежачих. После равномерного применения к внутренней стене эшафота с помощью инъекций, человека мезенхимальной стволовых клеток встроенных мембранной матрицы подвала демонстрирует ожидаемый мезенхимальной морфологии стволовых клеток, как оценивается путем сканирования электронной микроскопии.

После пересадки пищевода крысам с полными окружнотельными дефектами пищевода, как попродемонстрировано, трансплантат покрывается лоскутом щитовидной железы для стабильной фиксации и сосудистого снабжения имплантированного участка. Пересаденные крысы пищевода остаются на уровне 340 граммов примерно через девять дней после процедуры, после чего животные быстро уменьшаются в весе по разным причинам, что приводит к смерти к 15-му дню. Хотя большинство крыс развивать не-пищеводной обструкции, вызванной hairballs, в целом нет грубых доказательств перфорации, анатомоз утечки с свищом, серома накопления, абсцесс формирования, или окружающих мягкой ткани некроза в любом экспериментальном животном.

Повторное эпителиализация места трансплантации может быть подтверждена окрашиванием иммунофлуоресценции для кератина, а регенерированный коллагеновый слой и волокна эластина могут быть четко замечены трихромным окрашиванием Массона. Регенерация мышечного слоя пищевода также свидетельствует об обильной неоваскуляризации, оцениваемой иммуногистохимическим анализом десмина. Успех этой процедуры зависит от стабильного обслуживания Т-трубки через фиксацию за шеей, чтобы обеспечить питание во время реконструкции пищевода.

Для преодоления ранней смертности, характерной для этой процедуры, технология органоидной или ранней васкуляризации может быть применена после имплантации пищевода для оказания помощи в функциональной реконструкции пищевода.