Трехмерная визуализация бактериальных клеток для точного клеточного представления и точной локализации белка
29 октября 2019 г.
В этом протоколе объясняется, как подготовить и смонтировать образцы бактерий для живой трехмерной визуализации и как реконструировать трехмерную форму кишечной палочки из этих изображений.
Поскольку бактерии настолько малы, люди часто забывают, что они трехмерные объекты. Наш протокол позволяет точно восстановительные формы как плоских, так и изогнутых клеток. Этот протокол требует лишь небольших изменений в стандартный микроскоп, и они легко доступны в сценариях MATLAB.
Перед началом эксперимента поместите две стопки каждой из трех 20 на 20 миллиметров крышки скользит на противоположных концах одного стеклянного микроскопа слайд. Pipette 200 микролитров раствора агарозы площадку на слайде и сразу же и твердо место второй слайд на стек крышки скользит, чтобы сгладить агарозу. После разрешения агарозы затвердеть в течение одной минуты при комнатной температуре тщательно соскользнуть верхней слайд и использовать большой конец 200 микролитер пипетки отзыв вырезать отдельные пять миллиметров диаметром колодки из геля.
Когда все колодки были получены пипетки E.coli клеточной культуры несколько раз, чтобы нарушить любые клеточные сгустки и обеспечить, чтобы клетки однородно распределены перед добавлением одного микролитер субкультуры на каждой площадке. После сдачи образцов воздух сухой в течение пяти до 10 минут подтверждают, что капли были полностью поглощены в колодки перед размещением крышку скольжения на колодки. Затем используйте ватный тампон, чтобы аккуратно почистить соответствующий герметик по краю крышки скольжения, заботясь, чтобы держать герметик от верхней части крышки скольжения.
Сразу же после уплотнения крышки скольжения место слайд на стадии микроскопа и после пяти минут тепловой эквилибрации использовать микроскоп фокус колеса довести середину клетки в центре внимания. В связанном программном обеспечении микроскопа в соответствии с ND Acquisition, проверьте коробку q, чтобы приобрести стек и нажмите кнопку Home, чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага до 0,1 микрометра и диапазон до четырех микрометров и убедитесь, что устройство q установлено на сцене Пьезо.
Очень важно, чтобы на верхней и нижней части клетки было достаточно размытия, так что клетка почти неотличима от фона. Установите флуоресцентные каналы под окном лямбды в настройки для флуоресцентных молекул, которые будут изображены и подтвердите, что порядок эксперимента установлен на lambda так, что полный стек q будет получен в каждом цветном канале перед переключением. Затем нажмите Run now, чтобы начать приобретение изображения.
Когда все изображения были приобретены открыть файлы в соответствующей программе анализа изображений. Нарисуйте коробку вокруг отдельной ячейки и дублируйте эту ячейку два раза, один раз для каждого канала, убедившись, что коробка с гиперстахом Duplicate проверена, и измените канал на один или два. После того, как оба стека доступны, выберите изображения, стеки, инструменты и Concatenate для объединения изображений.
С каналом протеина сперва и каналом формы вторым. После сохранения нового изображения в качестве файла TIFF сделайте папку внутри папки на рабочем столе, которая содержит обрезанные изображения и cell_shape_settings_tri. txt файл из ша-клеток-общественных exampleData_tri.
Отредактировать cell_shape_settings_tri. txt файл, чтобы иметь правильные настройки для эксперимента интереса. И запустите Cell_shape_detector3dConvTriFolder функцию со строкой в расположение папки, а затем количество ячейки, на которой начать и количество ячеек, которые должны быть запущены.
Чтобы подтвердить, что ячейки были должным образом реконструированы запустить ScreenFits. Когда графический пользовательский интерфейс открывается, нажмите кнопку Select Folder и выберите папку с файлами данных реконструкции, чтобы визуально экран отдельных реконструкций ячейки. Для любой ячейки, которая появляется деформированной или которая не имеет полного покрытия, выберите поле рядом с реконструкцией, чтобы прибвести FLAG к имени, чтобы она можно было исключить из любого анализа ниже по течению.
Вы запустите enrichmentSmothingSpline, чтобы создать профиль обогащения относительной концентрации белка интереса как функции гауссийской кривизны на поверхности. Затем выберите каждую папку с только что созданным TRI. мат файлы и выбрать вновь созданный файл кривой коврик.
Этот метод особенно полезен при работе с изогнутыми или аномально сформированными клетками, так как 2D-представление не может точно отражать кривизну клеток. В этом эксперименте зеленый флуоресцентный синтез белка бактериального белка актина MreB был создан для изучения точной локализации белка актина как в диком типе, так и в мутантных клетках E.coli. Делая эти измерения в 3D захваченных изображений формы как дикого типа и стержня мутантных клеток были в состоянии быть реконструированы.
Затем было установлено, что локализация MreB будет обогащена небольшими искривлением Гауссии, геометрической особенностью, которая может быть измерена только в 3D зависимой манере. Не забудьте убедиться, что стек q достаточно велик, чтобы клетки были размыты сверху и снизу и чтобы клетки хорошо отозрались друг от друга. Мы показываем, как измерить геометрическую локализацию белков в 3D, но другая информация может быть рассчитана из этих данных, таких как размер сборки белка тегов.
Обзор
В данном протоколе описывается способ подготовки и закрепления образцов бактерий для трехмерной визуализации живых клеток, а также метод реконструкции трехмерной формы E. coli на основе полученных изображений. Данный метод позволяет точно визуализировать как плоские, так и изогнутые бактериальные клетки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические сведения
- Бактерии представляют собой трехмерные объекты, однако зачастую их изучают в двух измерениях.
- Точная реконструкция формы имеет важное значение для понимания морфологии бактерий.
- В данном протоколе используется стандартное микроскопическое оборудование с определенными модификациями.
- Для визуализации специфических клеточных компонентов могут быть использованы флуоресцентные белки.
Цель исследования
- Разработать метод реконструкции трехмерной формы *E. coli*.
- Изучить локализацию белков внутри бактериальных клеток.
- Углубить понимание морфологии бактериальных клеток.
Используемые методы
- Приготовление агарозных подушечек для монтажа бактериальных образцов.
- Использование микроскопа для получения Z-стеков изображений.
- Анализ изображений для реконструкции формы клеток на основе полученных снимков.
- Применение скриптов MATLAB для обработки и анализа данных.
Основные результаты
- Успешная реконструкция трехмерной формы клеток E. coli дикого типа и мутантных штаммов.
- Было установлено, что локализация белка MreB обогащена в областях с малой гауссовой кривизной.
- Данный метод эффективно фиксирует сложность изогнутых форм бактерий.
- Продемонстрирована важность 3D-визуализации при изучении морфологии бактерий.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод трехмерной визуализации бактерий.
- Он позволяет детально проанализировать локализацию белков в зависимости от формы клетки.
- Этот подход может быть применен в различных исследованиях морфологии бактерий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная 3D-реконструкция формы бактериальной клетки и локализации белков восполняет критический пробел в микробиологических исследованиях, где 2D-визуализация скрывает морфологические и пространственные функциональные взаимосвязи. Эта возможность позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней, связывая поведение белков с геометрическими особенностями клетки, такими как гауссова кривизна, которые невозможно разрешить в 2D. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, предоставляя количественные данные с пространственным разрешением о распределении белков в условиях, близких к нативным клеточным контекстам.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем корреляции локализации белков с параметрами 3D-формы клеток, такими как гауссова кривизна.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации целевых белков в физиологически релевантных клеточных морфологиях.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, выявляя пространственную регуляцию белков в нативных 3D-средах клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет получать стандартизированные количественные профили 3D-формы и обогащения белков, подходящие для высокопроизводительного скрининга.
- Воспроизводимость: Использование стандартизированного сбора Z-стеков и обработки на базе MATLAB обеспечивает согласованную реконструкцию формы в разных экспериментах.
- Масштабируемость: Совместимость с распространенными флуоресцентными микроскопами и адаптивность к различным видам бактерий и мутантам обеспечивают возможность повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными открытиями и доклиническими исследованиями, предоставляя данные о пространственной локализации белков, которые необходимы для функционального анализа в моделях соответствующих заболеваний.
- Механистическое снижение рисков: позволяет определить, зависят ли наблюдаемые белковые фенотипы от формы, что снижает количество ложноположительных результатов при валидации мишени.
- Согласование биомаркеров: позволяет выявить паттерны распределения белков, связанные с кривизной, которые могут служить трансляционными биомаркерами в морфологически различных состояниях бактерий.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, обеспечивая проверку гипотез при валидации мишеней и позволяя осуществлять переход к идентификации ведущих соединений и доклинической оценке на основе данных о локализации белков с учетом механизмов их функционирования.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез путем установления связи между локализацией белков и 3D-морфологическими признаками, что позволяет прояснить функциональные взаимосвязи в клеточных путях.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу количественных данных, включая карты гауссовой кривизны и профили обогащения белков для сравнительного анализа условий.
- Аналитика: предоставляет кривые обогащения белков на основе формы, которые позволяют количественно оценить пространственные зависимости и сравнить генетические условия или эффекты терапии.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность доклинических исследований, предоставляя данные с пространственным разрешением, которые могут подтвердить взаимодействие с мишенью в морфологически релевантных бактериальных моделях.
- Корпоративное использование: создает возможность повторного использования методов визуализации и анализа в рамках нескольких проектов по изучению морфологии бактерий и функций белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая точную локализацию белков в 3D, что повышает точность валидации мишеней.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки образцов, получения Z-стеков и автоматизированной реконструкции на базе MATLAB.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), выявляя, зависит ли локализация белка от формы, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе пространственно подтвержденных функциональных данных в нативном клеточном контексте.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией, анализом изображений и вычислительной обработкой на базе MATLAB.
- Необходим доступ к флуоресцентному микроскопу с пьезоэлектрическим столиком и достаточным объемом вычислительных ресурсов для 3D-реконструкции.
- Требуется стандартизация подготовки образцов, параметров Z-стека и рабочих процессов обработки изображений для всех групп исследователей.
- При применении метода к различным видам бактерий, формам или флуоресцентным меткам необходимо учитывать особенности адаптации.
- Ограничено высокой вычислительной сложностью 3D-реконструкции, при этом использование высокопроизводительных ресурсов рекомендуется, но не является обязательным.
