Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Moreno Zamai; Antonio Trullo; Elvira Arza; Ugo Cavallaro; Valeria  R. Caiolfa

doi:10.3791/60398

Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней ...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней флуоресценции в сочетании с анализом числа и яркости

Full Text

7,349 Views

10:43 min

November 6, 2019

DOI: 10.3791/60398-v

Moreno Zamai¹, Antonio Trullo², Elvira Arza¹, Ugo Cavallaro³, Valeria R. Caiolfa^1,2

¹Unit of Microscopy and Dynamic Imaging,Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, ²Centro di Imaging Sperimentale,Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, ³Unit of Gynecological Oncology Research,European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents an innovative imaging technique to assess the oligomeric state of mEGFP-tagged receptor oligomers on the plasma membrane of living cells, particularly in response to ligand binding. Using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy alongside Number and Brightness (N&B) analysis, the researchers can explore receptor dynamics in real time.

Key Study Components

Research Area

Cell biology
Microscopy
Molecular biology

Background

Receptor clustering is critical for signaling pathways.
Measuring receptor clustering has been challenging due to limited methods.
TIRF microscopy provides fast imaging capabilities near the cell surface.

Methods Used

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy
HeLa cells
Number and Brightness (N&B) analysis

Main Results

The protocol successfully tracks diffusion of FGFR1-mEGFP molecules.
Average oligomeric states were determined post-ligand binding.
This method facilitates real-time observation of receptor dynamics.

Conclusions

The study offers a reliable approach to connect spatial and temporal organization of receptors.
This method has broad applications for studying protein clustering and signaling in live cells.

Frequently Asked Questions

What is TIRF microscopy?

TIRF microscopy is a technique that allows imaging of fluorescent molecules at or near the surface of cells.

Why is measuring receptor clustering important?

Receptor clustering is essential for effective signal transduction in cellular signaling pathways.

What is Number and Brightness (N&B) analysis?

N&B analysis determines the fluorescence intensity of molecules to infer their oligomeric state.

Can this method be used for proteins inside the cell?

No, this method is designed for proteins on the cell membrane; other microscopy techniques are needed for intracellular proteins.

What type of cells were used in the study?

HeLa cells were used for the experiments.

Is prior experience with fluorescence methods necessary?

Basic knowledge of fluorescence fluctuation methods is required to apply this technique.

What temperature is required for the experiment?

The experiments are conducted at 37 degrees Celsius.

Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).

Кластеризация рецепторов повсеместна и часто необходима для сигнализации каскадной активации. Однако для измерения степени кластеризации имеется мало методов. Мы используем полную внутреннюю флуоресценцию отражения, микроскопию TIRF, чтобы следить за диффузией молекул FGFR1-mEGFP в плазменной мембране живых клеток.

Затем мы применяем яркость числа, анализ N и B, чтобы описать динамику кластеризации стимулирующих рецепторов. TIRF идеально подходит для быстрой височной визуализации молекулярных событий, происходящих вблизи поверхности клетки, в то время как N и B определяет среднее олигомерное состояние флуоресцентных молекул на основе того, где диффузия в и из объема освещения микроскопа. Действительно, это инструмент для подключения пространственной временной организации рецепторов на поверхности клетки, где они сигнализируют.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Биология Выпуск 153 Кластеры рецепторов N и B Количество и яркость анализ момента олигомеры белка клеточная мембрана tIRF микроскопия