6,692 Views
•
10:43 min
•
November 06, 2019
DOI:
Кластеризация рецепторов повсеместна и часто необходима для сигнализации каскадной активации. Однако для измерения степени кластеризации имеется мало методов. Мы используем полную внутреннюю флуоресценцию отражения, микроскопию TIRF, чтобы следить за диффузией молекул FGFR1-mEGFP в плазменной мембране живых клеток.
Затем мы применяем яркость числа, анализ N и B, чтобы описать динамику кластеризации стимулирующих рецепторов. TIRF идеально подходит для быстрой височной визуализации молекулярных событий, происходящих вблизи поверхности клетки, в то время как N и B определяет среднее олигомерное состояние флуоресцентных молекул на основе того, где диффузия в и из объема освещения микроскопа. Действительно, это инструмент для подключения пространственной временной организации рецепторов на поверхности клетки, где они сигнализируют.
N и B нужен только доступ к микроскопу с модулем быстрого приобретения. Вы можете проанализировать большую площадь живых клеток, имеющих только базовые знания методов флуктуации флуоресценции. Этот метод может быть применен к белкам, которые образуют димеры или кластеры и могут быть стоихиометрически помечены флуоресцентным красителем.
Если белки находятся во внутриклеточных отсеках, другие типы микроскопов используются для приобретения изображений. Важно подготовить конструкцию, которая выражает мономерную форму флюорофора для измерения в экспериментальных условиях чистой мономерной яркости в качестве контроля. В первый день семенные клетки HeLa в 1,5 миллилитров полной среды в концентрации от 100 000 до 200 000 клеток на миллилитр в стеклянно-нижней посуде.
Семена от шести до восьми реплицируют блюда и инкубируют в инкубаторе при 37 градусах цельсия. На второй или третий день клетки достигли субвлияния. Добавьте безотхвкую среду с белковой плазмидой в половину блюд и добавьте эталонные плазмиды с мономером и димером во вторую половину блюд, чтобы пролифицить клетки.
Через день проверьте, что трансфицированные клетки придерживаются дна посуды и клеточная мембрана флуоресцентная. Откажитесь от блюд с заросшими клетками или с очень низкой флуоресценцией. За четыре часа до начала эксперимента активируйте температурный инкубатор микроскопа при температуре 37 градусов по Цельсию.
Включите микроскоп, компьютеры и камеры, и ждать камеры, чтобы достичь надлежащей рабочей температуры минус 75 градусов по Цельсию. Поместите небольшую каплю масла на объектив цели. Положите образец блюда в инкубатор микроскопа, и закрыть двери инкубатора, чтобы температура блюда равновесной в течение 10 минут.
Включите лампу эпифлуоресценции и 488-нанометровый лазер. Выберите режим контрастности эпифлюоресценции, чтобы исследовать образец, ища клетку, чтобы сосредоточиться на глазной линзе. Выберите правильный фильтр для сбора зеленого излучения через микроскоп камеры с bandpass Ex 490/20 500 и bandpass Em 525/50 или аналогичный.
Переключитесь с глазного на кулачок в режиме эпифлуоресценции. Уточните фокус и измените режим TIRF. Затем активируйте автоматическое выравнивание в соответствии с инструкциями микроскопа TIRF.
Выберите подходящую глубину освещения и оптимизируйте направление эвакуационные поля. Переключитесь на вторую камеру. Определите область, интересную не менее 256 на 256 пикселей.
Установите воздействие на одну миллисекунду, а EM получить до 1000. Отрегулируйте мощность лазера до 0,5 милливатт. Необходимо иметь некоторую информацию о коэффициенте диффузии белка, потому что время экспозиции должно быть короче, чем среднее время, проведенное флуоресцентными молекулами в освещенном объеме.
Запустите первую пробную последовательность при первоначальных условиях и приблизительно оцените значение сигнала к шуму. Условия приемлемы при сигнале к шуму, равном двум-трем или выше, как это измеряется в первой серии времени. Затем используйте ползунок системы расщепления выбросов, соединяющей камеру номер два с микроскопом для маскировки стороны изображения.
Выберите опцию автоматического сохранения файла камеры. Начните приобретение серии изображений как минимум за 700 кадров при минимальном соотношении сигнала к шуму в два. Не вынюхив блюдо из микроскопа, добавьте лиганд.
Выберите ячейку с яркой флуоресцентной мембраной и быстро запустите первую серию кинетических запусков. Поиск второй ячейки, и приобрести вторую точку времени кинетики. Захват новой ячейки для каждой точки времени кинетического запуска.
Для каждого нового блюда повторите выравнивание лазерной линии и оптимизацию освещения TIRF. Теперь конвертировать и сохранить файлы изображений, приобретенные с помощью программного обеспечения камеры в качестве тиф-файлов. Импорт tif файлов в анализ программного обеспечения рутины путем активации N и B графических пользователей интерфазы MATLAB.
Отбросить серию, для которой средний профиль интенсивности показывает более 10%photobleaching и серии, в которых наблюдается очевидное искажение клеточной мембраны или перевод во время приобретения. Урожай кадры, которые, очевидно, не в фокусе. Держите для анализа только серии, по крайней мере 500 таймфреймов.
Сначала определите параметры камеры. Активируйте обычную калибровочную камеру. Выберите область размером не менее 20 на 50 пикселей в области шума детектора.
В частоте журнала по сравнению с цифровым сюжетом уровня перемести линейный красный курсор, чтобы разграничить гауссийский язык в линейной части кривой. Активируйте клавишу B. Применить минимальное binning 2.2 для уменьшения дисперсии данных и для создания Гистограммы B-I.
Используйте итеративный квадратный курсор для проверки гистограммы B-I. Выберите квадратную рентабельность инвестиций для анализа и создать B-карту выбранной рентабельности инвестиций. Затем сохраните файл ASCII B-значений, связанных с выбором.
Импорт ASCII в графическом программном обеспечении для вычисления частотного распределения данных и получения среднего B-значения плюс или минус S.E.Apply уравнение эпсилон для получения средней яркости для каждой ячейки в каждый момент кинетического запуска. Нормализация данных в соответствии с уравнением нормализации, где B’t является средним B-значением, измеренным во время t после добавления лиганда и B’0, является средним B-значением, измеренным в то время, когда t равен нулю, что составляет от 10 до 20 секунд после лигандового аддитино. Участок нормализованной средней яркости по сравнению с приобретением времени для создания кинетического запуска.
В этом исследовании показаны репрезентативные результаты двух клеток HeLa в одном и том же блюде, выражаюющих mEGFP-FGR1, захваченных во время нуля и семи, после добавления 20 нанограмм на миллилитр FGF2. По сравнению с эталонные конструкции, GPI-mEGFP и GPI-mEGFP-mEGFP dimer, вся последовательность анализа показывает среднюю интенсивность тайм-ряда. Участок всех B-значений.
Гистограмма B-I. B-карта выбранной рентабельности инвестиций. И связанная с этим Гистограмма B-распределения.
После стимуляции с 20 нанограмм на миллилитр FGF2, репрезентативные кинетические трассы, показывающие среднюю яркость как функцию времени, описывают медленный процесс димеризации, который сохраняется в течение нескольких минут на поверхности клетки. При стимуляции с 50 микрограмм на миллилитр NCAM-Fc, кинетический профиль показывает быстрые и циклические переходы рецептора в олигомерных смесей, который также достигает значения яркости выше, чем у димера. Неоднократно наблюдалось нормализованное среднее значение в три.
Важно минимизировать дополнительные варианты из-за отсутствие молекулярных колебаний и отбеливания. А клетки должны быть хорошо привязаны к стеклянно-нижней тарелке, не заросшие и не скапливаемые. Если мы заинтересованы в белке, который быстрее рассеивается внутри внутриклеточных отсеков, мы можем применять более быстрые нулевые времена и использовать сканирование на фокусных или мультифотонных микроскопах для изображения внутри клетки.
С помощью нашего подхода мы минимизируем пагубные последствия фотоотверга, когда хотим изучить динамику таких событий, как димеризация. Эти события контролируют различные клеточные реакции и очень трудно доказать в живых клетках с другими методами.
Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).
Copy