Повышение долговечности диссоциированных культур нервных клеток с использованием биологически активного кораллового матрикса

Значение этого протокола заключается в том, что он предоставляет новый способ увеличения долговечности и роста нейронов, глии и стволовых клеток in vitro. Он применим и для других ячеек. Основным преимуществом методики является использование матрицы из кораллового скелета.

Этот матрикс питает и защищает нервные клетки, а также способствует их росту. Поддерживая нервные клетки in vitro, коралловый скелет может функционировать аналогично регенеративному имплантату в местах черепно-мозговых травм. Для начала с помощью молотка разбейте коралловый скелет и разделите его на фрагменты размером от 0,5 до двух сантиметров.

Для того чтобы растворить органические и неорганические остатки, замочите фрагменты скелета коралла в 10% растворе гипохлорита натрия на 10 минут. Затем промойте один раз двойной дистиллированной водой. Чтобы удалить оставшиеся органические остатки, замочите фрагменты в одном молярном растворе гидроксида натрия на пять минут, затем промойте один раз двойной дистиллированной водой.

Продолжайте удаление органических отложений, замочив фрагменты в 30% растворе перекиси водорода на 10 минут, и трижды промойте фрагменты двойной дистиллированной водой. Удалите как можно больше лишней двойной дистиллированной воды и оставьте фрагменты кораллов в капюшоне для высыхания. Затем очистите стекла крышек стекла, замочив их в 10 миллилитрах 95% этанола в 100-миллиметровой стеклянной чашке Петри.

Через 15 минут удалите этанол и трижды промойте водой двойной дистилляции, ожидая 10 минут между каждой стиркой. Удалите двойную дистиллированную воду и поставьте блюдо на предварительно разогретую нагревательную плиту с температурой 80 градусов Цельсия. Затем аккуратно помешивайте крышку стекла до тех пор, пока двойная дистиллированная вода не испарится.

Автоклав крышки скользки. Измельчите фрагменты кораллового скелета с помощью ступки и пестика до полного разрушения. Получается смесь зерен с размерами от 20 до 200 микрометров.

В качестве альтернативы измельчите фрагменты кораллового скелета с помощью электрической шлифовальной машины с длиной лезвия шесть сантиметров и шириной от 0,5 до одного сантиметра со скоростью 1000 об/мин в течение 30 секунд. Чтобы очистить зерна, переложите зерна на электрический фильтрующий сетчатый фильтр 40 микрон. Отрегулируйте настройки электрического фильтра на тряску со скоростью 600 амплитуд в минуту и отскок со скоростью шесть раз в секунду.

Затем автоклавируйте зерна. В стерильных условиях добавьте зерна кораллового скелета в 20 микрограммов на миллилитр PDL, растворенных в растворе Хэнка, чтобы достичь концентрации пять миллиграммов или 10 миллиграммов зерен на один миллилитр раствора PDL. Разлейте раствор по колбам и посуде в концентрации примерно два миллилитра на 25 квадратных сантиметров, и выдержите в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Зерна опускаются и прикрепляются ко дну. На следующий день вымойте колбы и посуду один раз стерильной двойной дистиллированной водой. Дайте колбам и посуде высохнуть в вытяжке.

Чтобы покрыть стекло крышкой, сначала добавьте зерна кораллового скелета в дважды дистиллированную воду в концентрации пять или 10 миллиграммов на миллилитр. Поместите чехол на нагревательную пластину, предварительно нагретую до 80 градусов Цельсия. Затем капните 40 микролитров зернового раствора на центр покровного стекла, и подождите 15 минут для полного испарения.

Это приведет к тому, что зерна прилипнут к покровному листу. Автоклавируйте покрытую крышку и храните в стерильных условиях. Далее поместите покровные стекла на крышку стерильной 24-луночной пластины, добавьте 100 микролитров 20 микрограмм на миллилитр раствора PDL на каждую крышку.

Используйте наконечник для того, чтобы жидкость покрывала всю область зерна и остальную поверхность скольжения крышки. Накройте крышкой дно тарелки, а боковые стороны места оберните парафиновой пленкой. Выдерживать в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующий день промойте чехол один раз двойной дистиллированной водой и просушите в капюшоне. После подготовки головы крысиного щенка, держите его изо рта большим пинцетом. Разрежьте маленькими ножницами кожу, покрывающую череп

Чистыми ножницами войдите под череп со стороны мозжечка и разрежьте череп справа и слева, чтобы обеспечить возможность его удаления. С помощью маленького пинцета отделите череп от мозга. Отделите мозг от головы и поместите его в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра холодного MEM.

Под стереомикроскопом с помощью двух небольших пинцетов рассеките гиппокамп. Переложите гиппокамп в подготовленную 35-миллиметровую посуду, содержащую МЭМ. Разрежьте гиппокамп примерно на один миллиметр с помощью скальпеля.

Добавьте 200 микролитров раствора трипсина. Аккуратно перемешайте и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия и 5-10% углекислого газа в течение 30 минут. После инкубации добавьте в чашку два миллилитра холодного МЭМ, чтобы обезвредить трипсин.

Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки с наибольшим диаметром перенесите трипсинизированную ткань в 15-миллилитровую пробирку, содержащую один миллилитр среды первого дня, предварительно нагретую до 37 градусов Цельсия. Растирайте ткань, пропуская ее через стеклянную пипетку самого большого диаметра от 10 до 15 раз. Затем повторите этот процесс с помощью стеклянной пипетки со средним диаметром.

Продолжайте растирание пипеткой наименьшего диаметра. Избегайте образования пузырей, чтобы уменьшить гибель клеток. Дайте разрозненным кусочкам ткани опуститься на две-пять минут.

Затем переложите надосадочную жидкость в другую 15 миллилитровую трубку. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Для достижения предпочтительной плотности клеток в пределах от 200 000 до 400 000 клеток на миллилитр.

Используйте средство первого дня для разбавления. Далее засейте по 100 микролитров ячеек на каждое стекло крышкой. Убедитесь, что вы закрыли ячейками всю крышку.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и углекислом газе от пяти до 10%. На следующий день добавьте в лунки 500 микролитров питательной среды для нейронов. С помощью пинцета извлеките среду первого дня, наклонив покровное стекло и осторожно переложив каждый покровный лист в соответствующую лунку.

Отсосите остатки среды из крышки. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и от пяти до 10% углекислого газа. Поддерживайте инкубатор в максимально увлажненном состоянии, используя поддон с водой на дне инкубатора.

Не заменяйте носитель. Культуры можно выдерживать в этих условиях до одного месяца. В этом исследовании ручные шлифовальные и электрические шлифовальные машины дали одинаковые результаты, при этом размер зерна варьировался от 20 до 200 микрометров.

Ручные или электрические сетчатые фильтры производили два типа зерновых смесей. Один с зернами размером от 40 до 200 микрометров, а второй с размером 40 микрометров и менее. Фазово-контрастные микроснимки показывают, что культивирование клеток гиппокампа на покровных листках, покрытых зернами кораллового скелета, формировало сложные нейронные сети в отсутствие и наличие матрикса.

Окрашивание ядра клеток показало, что через 14 дней после посева плотность клеток на матрице была выше, чем на непокрытых покровных листах. Окрашивание микротрубочками, ассоциированными со вторым белком, показало, что на матрице формируется сложная нейронная и дендритная сеть по сравнению с контролем. Кроме того, глиальные клетки, выращенные на матрице кораллового скелета, визуализированные с использованием глиального фибриллярного кислого белка, претерпели значительные морфологические изменения.

Они приобрели более колючий вид, с более длинными отростками, чем глиальные клетки, выращенные на контрольном субстрате, где они казались более круглыми и плоскими. При выделении клеток важно помнить о необходимости работать быстро, поддерживать pH путем добавления CO2 при необходимости и работать как можно мягче, чтобы предотвратить отслоение коралловых зерен.