Анализ молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез (TB-MBLA)
30 апреля 2020 г.
Мы описываем тест анализа молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез, проведенный после тепловой инактивации косточки. Тепловая инактивация делает образцы косточки неинфекционными и устраняет необходимость в лабораториях 3-го уровня сдерживания для молекулярных тестов на туберкулез.
Это туберкулез молекулярной бактериальной анализа, ответы на три ключевых вопроса. Первое: Какова величина бремени болезни пациента? Второе: Как бремя болезни пациента реагирует на противотуберкулезные препараты?
И три: Какова связь между бременем болезни и лечения ответ? Этот анализ дает количественный результат бремени туберкулеза пациента, и измеряет, как это бремя меняется с лечением в течение короткого времени. С модификацией эта методология может быть применена к другим бактериальным патогенам.
Мы уже разработали аналогичную технологию диагностики нетрубоходных микобактерий и бактерий, связанных с хронической обструктивной болезнью легких. При выполнении этой техники в первый раз, смотреть видео и практиковать шаги. Очень важно практиковаться с образцами, которые не нужны для результатов диагностики пациентов.
Визуальная демонстрация имеет решающее значение, поскольку она упрощает обучение и освоение шагов, особенно тех частей метода, которые трудно объяснить в тексте. Начните с подготовки клеточных культур. На чистой лабораторной скамейке или в одной каюте, урожай один миллилитр aliquots экспоненциальной фазы Bacille Calmette-Guerin или BCG культуры в 15 миллилитров пластиковых трубок и плотно закрыть их.
При подготовке образцов мокроты пациента работайте в хорошо проветриваемом помещении и следуйте рекомендациям руководства GL One Stop TB. Аккуратно откройте чашку образца и пипетки один миллилитр aliquots в 15 миллилитров пластиковых центрифуг труб. Затем плотно закройте трубки.
Перенесите пробные трубки на стойку для держивок, погруженную в водяную баню, которая разогревается до 95 градусов по Цельсию, убедившись, что 3/4 каждой трубки погружено. Отварить образцы в течение 20 минут. Затем перенесите трубки на скамейку, чтобы охладить при комнатной температуре в течение пяти минут.
Выполните экстракции РНК в дым капот при использовании комплекта с фенол хлороформ или этанола опухолевых капитала. Процедура РНК, иллюстрированная здесь, является процедурой извлечения фенола хлороформа. Однако могут также использоваться альтернативные методы извлечения РНК.
Перенесите один миллилитр алицитов теплового инактивированного образца в 1,5 миллилитровые трубки и шип 100 микролитров контроля экстракции в каждый образец. Закройте трубки и смешайте их, инвертирование три раза. Центрифуга труб при 20 000 раз г в течение 10 минут.
Затем, аспирировать супернатант, оставляя 50 микролитров осадков. Мы приостанавливаем осадок в 950 микролитров буфера лиза путем трубопроводирования и переводим всю подвеску в лизающие матричные трубки, поставляемые с набором для извлечения РНК. Плотно закройте трубки и убедитесь, что они помечены как на крышке, так и на стороне.
Затем гомогенизируйте образцы в течение 40 секунд при 6000 об/мин. Центрифуга лисировать при температуре 12 000 раз в течение пяти минут при комнатной температуре. Между тем, подготовить свежие один миллилитров трубки, и добавить 300 микролитров хлороформа.
Используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы тщательно аспирировать супернатант, не касаясь матрицы лизирования и перенести его в трубку с хлороформом. Vortex труб в течение пяти секунд и оставить их поселиться в течение пяти минут или до трех этапов хорошо видны. Центрифуга труб на 12000 раз г в течение пяти минут.
Затем осторожно пипетку верхней фазы и передать его в 1,5 миллилитров трубки. Добавить 500 микролитров ледяного 100% этанола в образец, закрыть трубку, и инвертировать его три раза, чтобы смешать. Инкубировать трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Затем загрузите трубки в предварительно охлажденную микро центрифугу и центрифугу в течение 20 минут при 13 000 раз г и четыре градуса по Цельсию. Откажитесь от супернатанта, добавьте 500 микролитров 70%ледяного этанола и центрифуги еще на 10 минут при 13 000 г. Отбросьте все супернатанты.
И инкубировать трубки при 50 градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы высушить гранулы нуклеиновой кислоты, убедившись, что держать трубы частично открытыми, чтобы позволить испарение этанола. Затем добавьте 100 микролитров воды без ядра в гранулы и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Vortex образца в течение трех секунд и приступить к удалению ДНК или хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
Подготовлена одна смесь ДНК в соответствии с рукописными указаниями и пипеткой 11 микролитров в каждую трубку, содержащую экстракт РНК. Vortex в течение трех секунд и спина вниз кратко, чтобы удалить любые капли со стенки трубки. Затем инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут в горячем блоке или инкубаторе.
После инкубации добавьте еще один микролитер одного фермента ДНК непосредственно в трубку и хорошо перемешайте вихрем. Затем инкубировать трубки еще 30 минут при 37 градусах по Цельсию. Оттепель и вихрь реагент инактивации ДНК.
Затем добавьте 10 микролитров к каждому экстракту РНК. И инкубировать трубки при комнатной температуре в течение пяти минут. Вихрь труб три раза во время инкубации шаг.
Затем центрифуга смеси на 13000 раз г в течение двух минут и тщательно передать супернатант в 1,5 миллилитров РНК свободной трубки, убедившись, чтобы не касаться любой из матрицы инактивации. Разбавить все неизвестные образцы РНК от одного до 10 в свободной воде РНК, то, смешать их вихрем в течение пяти секунд и кратко спиннинг их вниз. Оттепель MTB и EC-РНК образцов и сделать семь и шесть десятикратных разбавления соответственно для стандартной кривой.
Подготовка RT плюс и RT минус ПЦР мастер смеси в соответствии с рукописными направлениями. Vortex RT плюс смесь и передачи 16 микролитров в каждый RT плюс ПЦР трубки. Затем вихрь RT минус смесь и добавить 16 микролитров в каждый RT минус ПЦР трубки.
Добавьте четыре микролитров экстракта РНК или воды и дублируйте в RT плюс трубки. Вода является не-шаблон управления или NTC. Добавьте четыре микролитров экстракта РНК или воды в трубки RT минус.
Загрузите реакционной трубки в машину ПЦР в режиме реального времени, запрограммировать реакцию, описанную в рукописи, и запустить реакцию. Для интерпретации реакции на лечение используйте стандартную кривую для преобразования значений СЗ в бактериальную нагрузку и расчета реакции в качестве изменения бактериальной нагрузки в течение периода последующей обработки. Падение бактериальной нагрузки после лечения означает положительный ответ, в то время как никакие изменения или рост бактериальной нагрузки не означает негативной реакции.
Для проверки того, что все бациллы М.туберкулеза были активированы теплом, была измерена оптическая плотность клеток и сопоставлена с плотностью живых клеток. Никаких изменений в OD с течением времени не наблюдалось для тепла инактивированных образцов, указывающих на отсутствие роста. Тепловые инактивированные образцы были инкубированы при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы определить, ухудшается ли РНК после тепловой инактивации клеток.
Не было обнаружено никакой разницы между РНК, собранной сразу после тепловой инактивации, и РНК, изолированной один, два, три и четыре дня спустя как в культурах BCG, так и в положительной мокроте туберкулеза. Когда фермент РНК А был экзогенно добавлен в образцы, до и после тепловой инактивации, потеря РНК произошла во всех тепловых инактивированных образцах в течение четырех дней инкубации. Влияние тепловой инактивации на рибосомную РНК измерялось в культурах BCG и мокроте у пациентов с положительным туберкулезом.
Измеренная бактериальная нагрузка контрольной культуры была выше, чем комбинированная бактериальная нагрузка тепловой инактивированной культуры на 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию для образцов BCG и мокроты. Тепловая инактивация образцов приводит к минимальной потере РНК, оставляя адекватную РНК для ниже по течению TB-MBLA и других молекулярных тестов ниже по течению. Передача Электронная микроскопия была использована для исследования ли клетки литья тепловой инактивации.
Проверка клеток при нижнем и более высоком увеличении выявила нетронутые клеточные стенки и видимые внутриклеточные липидные тела. Клетки казались удлиненными, но не облились. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, чтобы добавить контроль извлечения, который контролирует любые ложные негативные результаты из-за плохой добычи РНК.
Этот подход может быть применен к бактериям, связанным с хронической обструктивной болезнью легких, нетуберной микобактериальной инфекцией и другими респираторными патогенами. Количественные результаты ТБ-МБЛА позволили математическим и фармако-моделированием того, как пациенты реагируют на туберкулезную терапию. Мы с нетерпением ожидаем применения этой методики в обычном уходе, где управляются больные туберкулезом.
Обзор
В данной статье описывается метод определения молекулярной бактериальной нагрузки при туберкулезе, который проводится после тепловой инактивации образцов мокроты. Этот метод делает образцы неинфекционными, что обеспечивает более безопасное тестирование без необходимости использования лабораторий с высоким уровнем биологической защиты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Инфекционные заболевания
- Диагностические методы
Теоретические основы
- Туберкулёз является значимой глобальной проблемой здравоохранения.
- Точное измерение бактериальной нагрузки имеет решающее значение для мониторинга лечения.
- Традиционные методы требуют высокого уровня изоляции из-за работы с инфекционными образцами.
- Термическая инактивация представляет собой более безопасную альтернативу при работе с образцами.
Цель исследования
- Разработать безопасный и эффективный метод определения бактериальной нагрузки при туберкулезе.
- Оценить степень выраженности заболевания у пациента и ответ на лечение.
- Предложить методологию, применимую к другим бактериальным патогенам.
Используемые методы
- Тепловая инактивация образцов мокроты при 95 °C.
- Экстракция РНК с использованием фенол-хлороформного метода или альтернативных способов.
- ПЦР в реальном времени для количественного определения бактериальной нагрузки.
- Построение стандартной кривой для обеспечения точности измерений.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет количественно оценить степень поражения туберкулезом.
- Он эффективно измеряет изменения бактериальной нагрузки при лечении.
- Методология может быть адаптирована для других бактериальных инфекций.
- Визуальные демонстрации способствуют обучению и освоению техники.
Выводы
- Разработанный анализ представляет собой безопасную альтернативу для тестирования на туберкулез.
- Он позволяет эффективно контролировать ответ на лечение.
- Существует потенциал для более широкого применения при диагностике других бактериальных патогенов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод TB-MBLA представляет собой количественный метод на основе RT-qPCR для измерения бациллярной нагрузки Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты, что позволяет объективно оценить степень тяжести заболевания и ответ на лечение. Благодаря включению этапа термической инактивации данный анализ позволяет безопасно работать с инфекционными образцами вне лабораторий с высоким уровнем биологической защиты, что способствует более широкому применению метода в рамках фундаментальных и трансляционных исследований. Эта возможность поддерживает валидацию мишеней и снижение механистических рисков при разработке противоинфекционных препаратов, обеспечивая получение воспроизводимых и количественно определяемых биомаркеров патогенной нагрузки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения изменений бактериальной нагрузки как прямого показателя взаимодействия с мишенью и эффективности препарата.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый метод измерения нагрузки патогена, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественное измерение зависимой переменной (eCFU/mL) с помощью значений Cq и стандартных кривых, что позволяет проводить анализ «доза-эффект» и анализ временного хода при скрининге противомикробных препаратов.
- Практическая ценность: предоставляет масштабируемые результаты, совместимые с высокопроизводительным скринингом после экстракции РНК и RT-qPCR, что способствует стандартизации анализа при работе с библиотеками соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает поддержку систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем измерения бактериальной нагрузки в клинически значимых матрицах (мокрота), связывая результаты исследований in vitro с динамикой патогенов ex vivo.
- Практическая ценность: Способствует трансляционной преемственности от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя согласованный биомаркер ответа на лечение на всех этапах исследования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод TB-MBLA вписывается в континуум исследований — от раннего тестирования гипотез до оценки доклинической эффективности, где количественное определение патогенной нагрузки служит механистическим связующим звеном между воздействием соединения и биологическим результатом.
- Открытие в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала путем измерения бактериальной нагрузки в качестве функционального показателя противотуберкулезной активности.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных рабочих процессов экстракции РНК и RT-qPCR, которые дают количественные и воспроизводимые результаты для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет получать значения Cq и показатели eCFU/mL, рассчитанные по стандартной кривой, что дает возможность сравнивать различные условия и проводить статистический анализ эффектов терапии.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет использования образцов мокроты для отражения клинически значимой бактериальной нагрузки, что помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой многократно используемый метод количественного определения бактериальной нагрузки для различных патогенов, с доказанной применимостью к нетуберкулезным микобактериям и бактериям, ассоциированным с ХОБЛ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени с помощью количественного, механистически связанного биомаркера бактериальной нагрузки.
- Операционная ценность: Гарантирует воспроизводимость и масштабируемость за счет тепловой инактивации, стандартизированной экстракции РНК и RT-qPCR с использованием внутренних контролей экстракции.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах принимать обоснованные данные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе измеримых изменений нагрузки патогена.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя трансляционный биомаркер, который коррелирует с ответом на терапию на этапах поиска и доклинических исследований.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области молекулярной биобезопасности, работы с РНК и протоколов RT-qPCR для проведения этапов термической инактивации и экстракции.
- Зависимость от наличия оборудования для ПЦР в реальном времени, холодильных установок для хранения реагентов и лабораторных помещений, соответствующих требованиям биобезопасности, для первичной обработки образцов.
- Необходима межкомандная стандартизация методов экстракции РНК и использования контроля ингибирования для обеспечения согласованности результатов в разных центрах.
- Предусматривает необходимость адаптации при применении анализа к другим типам образцов или бактериальным патогенам, помимо Mtb.
- Включает практические ограничения, такие как потеря РНК в объеме <60% log10 eCFU/mL вследствие лизиса, вызванного термической инактивацией, что может повлиять на чувствительность при анализе образцов с низкой бактериальной нагрузкой.
