Контроль скорости потока microtubule основе 3D активных жидкостей с использованием температуры

Активная материя используется в различных областях, таких как молекулярные тени. Чтобы вывести приложение на новый уровень, нам необходимо развить способность контролировать активную материю локально. Мы предоставляем простой в использовании метод, который не требует модификации активной жидкости.

Также не нужно изменять оптический путь микроскопа для достижения локального контроля над активной жидкостью. Наш метод может быть применен к широкому кругу систем, где основные реакции подчиняются ошибочному закону, такому как микротрубобулярный скользящий анализ или ферментные системы. Установка включает в себя систему циркуляции воды.

Если происходят утечки, вода может повредить микроскоп. Поэтому, прежде чем принять наш протокол, важно убедиться, что система утечка бесплатно. Наш протокол требует монтажа образца стекла на температурной стадии.

В то время как рукопись описывает процедуру монтажа, в ней отсутствуют механические тонкости, такие как обеспечение образца на сцене. Демонстрация процедуры, будет Teagan Бейт, Эдвард Джарвис, и Меган Варни. Тиган и Эдвард аспиранты, а Меган является студентом лаборатории.

Для приготовления активных жидкостей в трубке Эппендорфа смешайте 16 точечных семи микролитров по восемь миллиграммов на миллилитр микротрубочку с шестью точечными семью микролитровами из одной точки восемь микромоляных кинезинных моторных кластеров и одну точку один микролитр 500 миллимолярный DTT в высокосоленых M2B. Комплект микротрубочек, добавив 11 точки четыре микролитера семь процентов веса по весу полиэтиленгликоль. Затем активируйте кинезин-моторы, добавив два точечных восьми микролитров 50 миллимолярной АТФ.

Поддерживайте концентрацию АТФ, добавляя два точечных восьми микролитера запасов пируваткиназы/лактата дегидрогеназы и 13 точечных трех микролитров 200 миллимолярный фосфенол пируват. Уменьшите эффект отбеливания фотографий, добавив 10 микролитров 20 миллимолейных тролок, один пункт один микролитр из трех точений пять миллиграммов на миллилитр каталазы, один пункт один микролитр 20 миллиграммов на миллилитр глюкозы оксидазы, и один пункт один микролитр 300 миллиграммов на миллилитр глюкозы. Отслеживайте движение жидкости, добавляя одну точку шесть микролитров нулевой точки ноль два пятипроцентного объема по объему частиц трассировщика.

Добавьте высокосоленый M2B для достижения общего объема 100 микролитров. Далее, промыть полиакриламинид покрытием стеклянной слайд и крышка скольжения с DI воды. Высушите стаканы воздухом под давлением.

Поместите очки на чистую, плоскую поверхность. Вырезать три миллиметра в ширину канала в восковой пленке. Общая ширина такая же ширина, как стеклянная крышка скольжения на 20 миллиметров.

Вставьте воск между слайдом и крышкой скольжения, чтобы сформировать канал потока клеток для жидкости. Придерживайтесь стекла к восковой пленке, поместив стеклянный восковый комплекс на 80 градусов по Цельсию горячей пластины, чтобы расплавить воск. Во время плавления, нажмите крышку скольжения осторожно с наконечником пипетки равномерно придерживаться восковой пленки на стеклянные поверхности.

После присадения охладите стеклянный комплекс до комнатной температуры. Быстрая загрузка подготовленных активных жидкостей в канал потока кончиком пипетки под углом от открытия канала и при контакте с поверхностью стеклянной горки. Печать канала ультрафиолетовым клеем.

После создания установки контроля температуры поместите образец активной жидкости на поверхность сапфира, а сторона слайда соеязвется с поверхностью. Закрепить стеклянную горку бумажной лентой. Используя медную ленту, прикрепите ThermoSensor к поверхности крышки скольжения.

Для установки установки на стадии микроскопа, с крышкой скольжения слайд лицом к целям, обеспечить установку с микроскопом этапе иглы зажимы. Включите контроллер температуры и насос аквариума. Следуйте руководству производителей, чтобы установить целевую температуру.

Включить контроль температуры. И записывать данные о температуре ThermoSensor. Изображение образца с постоянным временным интервалом на флуоресцентной микроскопии, оснащенной кубом фильтра GFP для мониторинга частиц трассировщика Alexa 488 в активной смеси.

Отрегулируйте интервал времени, чтобы смещение трассировщика между кадрами было в пределах девяти пикселей. Для трассировщиков изображений, движущихся со 10 микрометров в секунду с использованием четырех раз объективной, интервал времени рекомендуется от одной до пяти секунд. Сохраните изображения как файлы TIF, назовите файлы на основе номера кадра и храните их в отдельной папке.

Для этого кинезина приводом микротрубочек на основе активных жидкостей, температура контролировалась на 10, 20, 30 и 40 градусов по Цельсию. Колебания температуры были в пределах нулевой точки от одного до нуля точки три градуса по Цельсию в течение четырех часов, демонстрируя стабильность и надежность этой установки контроля температуры. Трассировщики были изображены каждые две секунды, что позволяло последовательно отслеживать траектории трассировки.

Средняя скорость, измеряемая при 20-36 градусах по Цельсию, оказалась почти независимой от нуля до двух часов. Там, где при 10 и 40 градусах по Цельсию средние скорости быстро разлагались, вызванные деполимеризацией микротрубочек ниже 16 градусов по Цельсию, и кинезинными кластерами, неисправными выше 36 градусов по Цельсию соответственно. Когда температура системы чередовалась между 20 и 30 градусами По Цельсию каждые 30 минут, средние скорости активных жидкостей не только ускорялись и замедлялись соответственно, но и реагировали на изменение температуры в течение 10 секунд.

Активные жидкости начинают неисправности, когда охлаждается ниже 16 или нагревается выше 36 градусов. Поэтому при манипулировании контроллером температуры убедитесь, что температура составляет от 16 до 36 градусов. Способность настройки активной жидкости локально, позволяет направлять энергию жидкости, такие как доставка грузов из точки А в точку Б или разработка устройства микрофлюидности, которое не требует физического клапана.

Акриламид используется для покрытия стеклянной посуды является нейротоксин, который может поглощать через кожу. Носите надлежащее защитное оборудование, такое как перчатки, лабораторные пальто и защитные очки, чтобы свести к минимуму риск.