Анализ сложных молекул и их реакций на поверхности с помощью кластерной индуцированной дезорпации/ионизации масс-спектрометрии
1 марта 2020 г.
Нейтральные so 2 кластеры низкой кинетической энергии (злт; 0,8 эВ/компонент) используются для десорбных сложных молекул поверхности, таких как пептиды или липиды для дальнейшего анализа с помощью масс-спектрометрии с помощью спектромера массы ионной ловушки. Специальная подготовка образца не требуется, и наблюдение реакций в режиме реального времени возможно.
Ионизация desorption, вызванная нейтральными кластерами SO2, которые мы называем коротким DINeC, является мягким и эффективным методом ионизации desorption. Мы используем его, в частности, для массовой спектрометрии биомолекул, таких как пептиды и белки. Как DINeC, молекулы desorption нетронутыми от поверхностей образца, тонкие химические изменения в этих молекулах легко обнаруживаются в масс-спектрах.
Этот процесс иллюстрируется в следующем моделировании. Входящие кластеры разрушаются при воздействии в кластерной поверхности. Поверхностный изотоп дипептида растворяется в одном из фрагментов скопления и разморабряется этим процессом.
В эксперименте луч скоплений SO2 производится с помощью сверхзвукового расширения от импульсного сопла. Молекулы, растворяемые и ионизированные при воздействии поверхности скопления, передаются в ионовую ловушку для масс-спектрометрии. Типичные масс-спектры показывают только пики на MO установленных значениях нетронутой молекулы.
Демонстрация процедуры будет Каролин Бомхардт, и Паскаль Шнайдер, два аспиранта в моей лаборатории. Для стандартных образцов, вырезать субстраты из кремниевых пластин толщиной около 0,5 до одного миллиметра на куски один на один квадратный сантиметр. Очистите силиконовые субстраты в ультразвуковой ванне этанола и ацетона в течение 15 минут каждый.
Высушите субстраты в потоке сухого азотного газа. Затем капля отбрасывает от 5 до 30 микролитров пробного раствора на субстрат. В зависимости от давления пара растворителя, дайте образцу высохнуть в условиях окружающей среды или в децикаторе до тех пор, пока весь растворитель не испарится и не образуется сухая пленка.
Рассмотрим простейшую схему подготовки. В качестве примера, для исследования маркер чернил, просто нарисуйте точку на поверхности субстрата. Намонтировать образцы на держатель образца с липкой лентой или зажимы затянуты винтами.
Кроме того, смонтировать эталонный образец, такой как микрометровая пленка ангиотензина II на держатель образца. Затем нажмите замок загрузки Vent, чтобы выпустить систему блокировки нагрузки. Подождите пять минут, или пока атмосферное давление не будет достигнуто.
Откройте блокировку нагрузки и смонтировать держатель образца. Закройте блокировку нагрузки и откачите камеру блокировки нагрузки до давления ниже двух раз 10 до отрицательных пяти миллибаров. Откройте клапан в камеру DINeC и перенесите держатель образца с переносным стержнем на основной манипулятор.
Прикрепите держатель образца к манипулятору. Увяди удилище и закройте клапан между блокировкой нагрузки и камерой DINeC. Откройте клапан между газовым баллоном и соплом.
Отрегулируйте давление диоксида серы и гелиевой газовой смеси на контуре системы газо смешивания до 15 бар. Установите положение манипулятора на положение эталонной выборки. Для измерения спектров катиоальной массы установите образец и сетку смещения до плюс 40 вольт и плюс семь вольт соответственно.
Для привода импульсного сопла и ионные ловушки масс-спектрометра, установить внешний генератор функции до двух Герц. С генератором задержки установите задержку времени между четким сигналом ловушки из ионой ловушки и триггерным сигналом для импульсного сопла до пяти миллисекунд. В программном обеспечении управления Bruker, в режиме страницы основного окна диалога, выберите расширенное разрешение для режима сканирования.
Введи M более 50-3000 для диапазона, введи в 0,1 миллисекунды для времени накопления, введи в 10 циклов в среднем, и для полярности, выберите положительный для измерения катионных спектров массы и отрицательный для измерения анионных спектров. После того, как давление ниже трех раз 10 до отрицательного шесть миллибар был достигнут в камере DINeC, начать измерение. Установите значение M над значением й до соответствующей массы, чтобы следить за сигналом хроматограммы, зависящим от времени.
Нажмите Работа в программном обеспечении управления. Начните записывать измерения, нажав кнопку Запись. Измерьте спектр тестов из эталонного образца, такого как ангиотензин II, в течение примерно 300 секунд.
Оптимизация интенсивности сигнала путем корректировки задержки времени между четким сигналом ловушки и сигналом, вызывая импульсный сопло. При оптимизации задержки времени переместите манипулятор в положение образца для измерений. Нажмите на кнопку Запись, чтобы получить массу спектров в течение периода времени интереса.
После завершения измерения загрузите соответствующий набор данных в программе анализа данных, показанный здесь для эталонного измерения. Выберите промежуток времени интереса к хроматограмме с правой кнопкой мыши. Средний спектр отображается в отдельном окне.
Нажмите на Export как файл ASCII для экспорта спектра в качестве файла данных для дальнейшей обработки в программе выбора. Спектр массы DINeC из образца Angiotensin II со временем изменился, так как образец нагревался до 140 градусов по Цельсию. Как только температура достигла конечного значения, пик атакованной протинированной молекулы на M над й равным 1047 упал и новые пики были замечены.
Процесс обобщен в этих трех графиках. Дополнительные пики на M более чем 932, 1012 и 1029 были хорошо соблюдены. Анализ реакционной кинетики показывает, что сущность с M над 1029 является промежуточным, который был дополнительно разложен на более мелкие фрагменты по мере того, как интенсивность сначала увеличивалась, а затем снижалась.
Наиболее важными особенностями DINeC являются мягкий характер процесса desorption, эффективность и высокая чувствительность поверхности. Все они приходят вместе с низкими требованиями в отношении подготовки образцов. Таким образом, DINeC может применяться к широкому спектру различных образцов, начиная от органических материалов коры и до сложных поверхностных адсорбатов в суб-монослойном регионе.
Во всех случаях полную химическую информацию можно получить в режиме реального времени.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод десорбционной ионизации с использованием нейтральных кластеров SO2, получивший название DINeC, для масс-спектрометрического анализа биомолекул. Этот метод позволяет в режиме реального времени наблюдать химические изменения в пептидах и белках без необходимости в трудоемкой подготовке проб.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Масс-спектрометрия
- Биомолекулярный анализ
- Химия поверхности
Теоретическая справка
- DINeC — это метод мягкой десорбционной ионизации.
- Он позволяет анализировать сложные поверхностные молекулы.
- Возможен мониторинг реакций в режиме реального времени.
- Требуется минимальная пробоподготовка.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективность метода DINeC для масс-спектрометрии.
- Проанализировать незначительные химические изменения в биомолекулах.
- Представить подробный протокол подготовки образцов и проведения измерений.
Используемые методы
- Генерация кластеров SO2 методом сверхзвукового расширения.
- Десорбция молекул при столкновении с поверхностью кластера.
- Перенос ионизированных молекул в ионно-ловушечный масс-спектрометр.
- Сбор данных и анализ масс-спектров в режиме реального времени.
Основные результаты
- Масс-спектры демонстрируют наличие интактных молекулярных пиков.
- По мере повышения температуры в ходе анализа появляются новые пики.
- Кинетика реакции указывает на образование промежуточных соединений.
- Метод DINeC демонстрирует высокую чувствительность к поверхности и эффективность.
Выводы
- DINeC — это универсальный метод, применимый к различным образцам.
- Он позволяет получать исчерпывающую химическую информацию в режиме реального времени.
- Минимальные требования к подготовке проб повышают практическую значимость данного метода.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
DINeC обеспечивает мягкую десорбцию/ионизацию сложных биомолекул с поверхностей без использования матрицы, что позволяет осуществлять мониторинг химических модификаций в режиме реального времени без трудоемкой подготовки образцов. Эта возможность расширяет возможности валидации мишеней и снижает риски при изучении механизмов на ранних этапах поиска путем получения количественных масс-спектров пептидов и белков без фрагментации с чувствительностью на уровне субмонослоя. Совместимость метода с ионно-ловушечной MSn позволяет проводить детальный структурный анализ, повышая прогностическую достоверность идентификации ведущих соединений и эффективность доклинических рабочих процессов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем детектирования целых молекулярных ионов и незначительных химических изменений в пептидах и белках.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет мягкой десорбции, которая сохраняет лабильные модификации, что уменьшает количество ложноотрицательных результатов в исследованиях взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: Предоставляет количественные данные о покрытии поверхности вплоть до 0,1% монослоя, что помогает в приоритизации портфеля препаратов на основе содержания мишени и статуса ее модификации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных масс-спектров без использования матрицы, что позволяет надежно определять аналиты, связанные с поверхностью, без подавления ионизации.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет стабильной генерации кластерного пучка и переноса в ионную ловушку, что сводит к минимуму вариабельность между сериями измерений.
- Масштабируемость: облегчает повторное использование платформы для различных типов образцов — от органических экстрактов до модифицированных поверхностей, что позволяет применять метод для высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет в режиме реального времени наблюдать за поверхностными реакциями, такими как H/D-обмен или термическое разложение, что обеспечивает возможность кинетического анализа стабильности биомолекул.
- Трансляционная преемственность: связывает этапы открытия и доклинических исследований, предоставляя непрерывную химическую информацию о поверхностных адсорбатах и молекулах в объеме при идентичных аналитических условиях.
- Принятие решений с учетом рисков: поддерживает критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем идентификации промежуточных продуктов деградации и путей реакций, которые могут повлиять на стабильность или эффективность потенциального лекарственного препарата.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
DINeC интегрируется в континуум открытий — от ранней валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической оценки, что особенно ценно для исследований, требующих чувствительного к поверхности мониторинга биомолекулярных взаимодействий или модификаций в режиме реального времени.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей за счет обнаружения посттрансляционных модификаций и лиганд-индуцированных конформационных изменений на поверхностях.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимой десорбции интактных молекул, предоставляя количественные данные для подтверждения хитов и картирования зависимости «структура-активность».
- Аналитика: Обеспечивает масс-спектры высокого разрешения и возможности MSn, которые позволяют командам сравнивать молекулярные состояния, сайты модификаций и паттерны фрагментации при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической валидацией путем мониторинга зависящих от времени химических изменений в пептидах и белках в условиях контролируемого термического или химического стресса.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как многократно используемый аналитический ресурс для различных отделов, сокращая избыточную разработку методов и обеспечивая согласованность данных между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет сохранения целостности молекул и обеспечения возможности обнаружения лабильных соединений, которые могут быть утрачены при использовании более жестких методов ионизации.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным параметрам пучка кластеров и минимальному воздействию на образец, что снижает техническую вариативность.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет отсутствия необходимости в матрицах и возможности прямого анализа нативных образцов, что снижает затраты на расходные материалы и время подготовки.
- Влияние на портфель: позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе кинетических данных о поверхностных реакциях в режиме реального времени, что способствует раннему выявлению критических недостатков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генерации кластерных пучков, работы ионных ловушек и принципов анализа поверхностей для оптимальной настройки установки и интерпретации данных.
- Необходим доступ к системе импульсных сопел, инфраструктуре для работы с диоксидом серы и гелием, а также к совместимому ионно-ловушечному масс-спектрометру с возможностью MSn.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов закрепления образцов, очистки и сушки подложек для обеспечения однородности поверхности и воспроизводимой эффективности десорбции.
- При переходе от модельных пептидов к сложным нативным образцам или гетерогенным поверхностям потребуются соответствующие адаптации, включая оптимизацию степени покрытия поверхности.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость создания условий сверхвысокого вакуума и возможные эффекты фрагментации кластеров при высоких энергиях удара, которые должны контролироваться для обеспечения «мягкой» десорбции.
