Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов
25 октября 2019 г.
Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.
Внутриклеточные бактерии выделяет белки эффектора в хозяина, который может манипулировать биологическими путями для содействия выживанию патогенов. Выявление принимающих целей эффекторов имеет важное значение для понимания внутриклеточных патогенов, таких как chlamydia trachomatis. Дрожжи токсичности и супрессор экраны могут обеспечить ключевое понимание в отношении естественной биологической цели бактериальных белков эффектора и может быть особенно полезным, когда связывающий партнер неизвестен.
Мы демонстрируем токсичность дрожжей и супрессор анализы здесь для скрининга на хламидиоз trachomatis эффектор белков, но этот метод также был использован для характеристики Legionella пневмофилы и Coxiella burnetii эффекторов. Начните с инокуляции пяти миллилитров одного выпадают бульона с одной колонией дрожжей, преобразованных с эффектором белка, содержащего плазмиду. Используйте дрожжи преобразованы с вектором только в качестве отрицательного контроля и инкубировать инокулум ночь при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.
На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в скважины A2 через скважины A6 из 96 скважин. Vortex ночной культуры и добавить 180 микролитров дрожжей хорошо A1. Затем последовательно разбавляют дрожжи в колодцах водой. Используйте многоканарный пипетку, чтобы обнаружить пять микролитров каждого разбавления на одну выпавку глюкозы и одиночные выпавные галактозные агарные пластины и инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов.
После инкубации, визуально оценить токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающих эффектор белка, выращенного на галактозсодержащих средств массовой информации для роста дрожжей, выражающих вектор в одиночку. Прививите 100 миллилитров одного выпавного бульона одним миллилитром ранее приготовленного дрожжевого бульона и инкубировать его в течение 16-24 часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании при 150 об/мин. На следующий день добавьте все 100 миллилитров ночной культуры в 900 миллилитров предварительно разогретого бульона и инкубировать колбу в течение четырех-пяти часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании.
После инкубации гранулы культуры в 6000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 250 миллилитров стерильной воды. Повторите центрифугу и отбросьте супернатант.
Затем повторно посовестите гранулы в 250 миллилитров одного миллимолярского литиевого ацетата. Пеллет культуры центрифугации, удалить ацетат лития, и повторно гранулы в 9,6 миллилитров 50%PEG 3350. Затем добавьте реагенты преобразования, описанные в рукописи, и отрегулируйте громкость до 15 миллилитров со стерильной водой, аккуратно переверкуемой для смешивания.
Инкубировать смесь при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров DMSO и инкубировать в водяной бане при 42 градусах по Цельсию еще 30 минут. Добавление DMSO до теплового удара имеет решающее значение для достижения высокой эффективности трансформации.
После инкубации, гранулы дрожжей центрифугирование на 3000 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и промыть гранулы с 10 миллилитров стерильной воды затем повторить центрифугации гранул дрожжей. Переусейте гранулы в восьми миллилитров воды.
Определите эффективность преобразования путем разбавления образца от одного до 10 и покрытия 100 микролитров каждого разбавления на двойной выпадают агар. Затем пластины 200 микролитров образца на двойной отсева галактозы агар пластин и инкубировать пластины при 30 градусов по Цельсию в течение 48 до 96 часов или до тех пор, пока колонии появляются. После того, как колонии появились, патч их на двойной отсева галактозы агар и инкубировать их еще на 24 до 48 часов.
Используйте часть патча, чтобы привить пять миллилитров двойного выпадают бульона и инкубировать инокулум на ночь при 26 градусах по Цельсию со тряской при 150 об/мин. На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в пять колодцев пластины из 96 скважин, начиная с колодца А2. Vortex ночь культуры смеси. Добавьте 180 микролитров дрожжей в скважину А1 и последовательно разбавляйте его водой в колодцах А2 через А6. Пятно пять микролитров каждого разбавления на одной отсева глюкозы и одного отсева галактозы агар пластин убедившись, что включить токсичный эффектор только в качестве контроля.
Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 часов, а затем сравнить рост дрожжей с токсичным эффектором только для роста дрожжей с потенциальным супрессором. Чтобы подтвердить супрессоры, которые продемонстрировали снижение токсичности по сравнению с токсичным эффектором в одиночку, изолировать плазмид в соответствии с рукописными направлениями и вновь превратить его в токсичные дрожжи. Прививка двойного отсева глюкозного бульона с колонией из трансформационной пластины.
Инкубировать его на ночь и пятно на двойной отсева глюкозы и галактозы агар, чтобы подтвердить подавление токсичности. Перед выполнением дрожжевой супрессор экран, эффектор белков, представляющих интерес были протестированы на токсичность в дрожжах. Интерес к белку выражался в дрожжах под контролем неуязвимого промоутера галактозы, а рост галактозы сравнивали с ростом глюкозы.
Когда CT229 был протестирован на токсичность, небольшие колонии и подавление роста наблюдались. В идеале, два-три журнала снижение следует наблюдать, чтобы приступить к дрожжевой супрессор экранов. Экран супрессора был проведен путем преобразования токсичного штамма с дрожжевой геномной библиотекой pYAP 13 и покрытием трансформантов на галактозном агаре.
Полученные клоны супрессора были замечены на двойном выбросе галактозного агара для подтверждения подавления токсичности. Супрессоры pSup1 и pSup2 подавляли токсичность белка-эффектора, в то время как pSup3 - нет. Эти процедуры требуют тщательного внимания к деталям в дополнение к критическим подготовительным работам, включая наличие большого количества средств массовой информации и пластин, готовых до проведения эксперимента.
После того, как супрессоры определены, эксперименты могут быть выполнены для проверки взаимодействия с эффектором интереса, включая тянуть падения, иммунофторесценции колокализации, эффектор нокаутом или нокдаун принимающих факторов, выявленных на экранах. Разработка этого метода для эффекторов хламидиоза позволила ускорить предварительную характеристику белков-эффекторов и помогла сосредоточить наши усилия на выяснении основных молекулярных механизмов, которые являются посредниками взаимодействия патогенов-хозяйцев.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод идентификации путей хозяина, на которые воздействуют токсичные бактериальные эффекторные белки, с использованием скрининга на токсичность и поиск супрессоров в дрожжах. Понимание этих взаимодействий имеет решающее значение для изучения молекулярного патогенеза внутриклеточных бактерий, таких как Chlamydia trachomatis.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Взаимодействия патогена и хозяина
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Бактериальные патогены секретируют эффекторные белки, которые манипулируют биологическими путями хозяина.
- Идентификация этих путей имеет важное значение для понимания заболеваний, вызываемых внутриклеточными бактериями.
- Дрожжевые модели могут быть использованы для скрининга эффектов этих эффекторных белков.
- Данный метод был применен к различным патогенам, включая Chlamydia trachomatis.
Цель исследования
- Выявить пути хозяина, на которые воздействуют токсичные бактериальные эффекторные белки.
- Изучить молекулярные механизмы патогенеза.
- Продемонстрировать полезность использования скрининга на токсичность и поиск супрессоров в дрожжах в данной области исследований.
Используемые методы
- Инокуляция дрожжей, трансформированных плазмидами с белком-эффектором.
- Использование отрицательных контролей с дрожжами, трансформированными только вектором.
- Инкубация культур при 30 °C с перемешиванием.
- Анализ роста дрожжей и токсичности для выявления взаимодействий белков-эффекторов.
Основные результаты
- Успешная идентификация путей хозяина, на которые воздействуют эффекторные белки Chlamydia trachomatis.
- Демонстрация эффективности дрожжевого скрининга при изучении бактериальных эффекторов.
- Представление о биологических мишенях различных бактериальных патогенов.
- Потенциальные возможности применения данного метода для других внутриклеточных бактерий.
Выводы
- Скрининги на токсичность и супрессоры в дрожжах являются ценными инструментами для изучения бактериальных эффекторных белков.
- Данный подход углубляет понимание взаимодействий между патогеном и хозяином.
- Дальнейшие исследования с использованием этого метода могут привести к разработке новых терапевтических стратегий борьбы с бактериальными инфекциями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Идентификация путей хозяина, подвергающихся воздействию бактериальных эффекторных белков, имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в поиске противоинфекционных средств. Скрининги токсичности и супрессоров на дрожжах обеспечивают функциональный, фенотипический подход к выявлению нарушений в биологии хозяина в тех случаях, когда традиционные анализы связывания оказываются неэффективными. Это позволяет получить понимание механизмов действия факторов вирулентности патогенов, что способствует повышению уверенности в выбранных мишенях на ранних этапах и приоритизации портфеля препаратов для борьбы с внутриклеточными патогенами.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая токсичность эффектора со специфическими путями хозяина посредством идентификации супрессоров.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени в случаях, когда белки-эффекторы не имеют обнаруживаемых партнеров по связыванию или взаимодействуют с многофункциональными белками хозяина.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению механистических рисков, выявляя нарушения на уровне путей, а не отдельные белковые взаимодействия.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: создание валидированных штаммов дрожжей, экспрессирующих эффекторные белки, для воспроизводимого скрининга токсичности.
- Количественный результат: измерение величины дефекта роста (например, снижение на два-три порядка) в качестве порога для перехода к скринингу супрессоров.
- Масштабируемость: использование 96-луночных форматов и метода последовательного разведения при споттинге для высокопроизводительной оценки клонов-супрессоров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Применимо к внутриклеточным патогенам, таким как Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila и Coxiella burnetii, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: Позволяет выявить факторы хозяина, подавление которых нивелирует токсичность эффектора, что обеспечивает последующую валидацию с помощью методов пул-дауна, колокализации или исследований на нокаутных моделях.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет сосредоточить усилия на эффекторах с подтвержденной модуляцией путей, снижая вероятность биологических неудач на поздних стадиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применяется на ранних этапах поиска для обоснования идентификации соединений-лидеров путем установления связи между экспрессией эффектора и нарушением путей хозяина, что позволяет осуществлять выбор мишени на основе полученных данных.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез, связывая экспрессию эффектора с дефектами роста дрожжей, что указывает на вмешательство в сигнальный путь.
- Скрининг: Позволяет получать готовые к анализу токсичные штаммы и библиотеки супрессоров для идентификации факторов хозяина, восстанавливающих фенотип.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели роста на селективных средах для сравнения токсичности эффекторов и эффективности супрессоров.
- Трансляционные исследования: Связывает выявленные в дрожжах супрессоры с гомологами млекопитающих для доклинической валидации в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимую платформу для скрининга библиотек эффекторов различных внутриклеточных патогенов.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней посредством функционального анализа сигнальных путей.
- Операционная ценность: Стандартизированные рабочие процессы скрининга токсичности и супрессоров с определенными порогами роста.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет фильтрации эффекторов, не оказывающих измеримого влияния на пути хозяина.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней-эффекторов с поправкой на риск на основе подтвержденной модуляции сигнальных путей.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области молекулярного клонирования дрожжей, экспрессии под управлением галактоз-индуцируемого промотора и трансформации библиотек плазмид.
- Необходимость использования оборудования для работы со стерильными культурами, центрифугирования и инкубации при 30°C с перемешиванием.
- Требуется межкомандная стандартизация приготовления сред, метода споттинга на чашки и критериев оценки токсичности.
- При адаптации метода следует учитывать совместимость промоторов, пороги токсичности эффекторов и валидацию супрессоров в системах млекопитающих.
- Практические ограничения включают необходимость в больших объемах сред и чашков, а также вероятность получения ложноотрицательных результатов в случае, если экспрессия эффектора токсична для штаммов библиотек дрожжей.
