Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов
October 25th, 2019
Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.
Внутриклеточные бактерии выделяет белки эффектора в хозяина, который может манипулировать биологическими путями для содействия выживанию патогенов. Выявление принимающих целей эффекторов имеет важное значение для понимания внутриклеточных патогенов, таких как chlamydia trachomatis. Дрожжи токсичности и супрессор экраны могут обеспечить ключевое понимание в отношении естественной биологической цели бактериальных белков эффектора и может быть особенно полезным, когда связывающий партнер неизвестен.
Мы демонстрируем токсичность дрожжей и супрессор анализы здесь для скрининга на хламидиоз trachomatis эффектор белков, но этот метод также был использован для характеристики Legionella пневмофилы и Coxiella burnetii эффекторов. Начните с инокуляции пяти миллилитров одного выпадают бульона с одной колонией дрожжей, преобразованных с эффектором белка, содержащего плазмиду. Используйте дрожжи преобразованы с вектором только в качестве отрицательного контроля и инкубировать инокулум ночь при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.
На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в скважины A2 через скважины A6 из 96 скважин. Vortex ночной культуры и добавить 180 микролитров дрожжей хорошо A1. Затем последовательно разбавляют дрожжи в колодцах водой. Используйте многоканарный пипетку, чтобы обнаружить пять микролитров каждого разбавления на одну выпавку глюкозы и одиночные выпавные галактозные агарные пластины и инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов.
После инкубации, визуально оценить токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающих эффектор белка, выращенного на галактозсодержащих средств массовой информации для роста дрожжей, выражающих вектор в одиночку. Прививите 100 миллилитров одного выпавного бульона одним миллилитром ранее приготовленного дрожжевого бульона и инкубировать его в течение 16-24 часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании при 150 об/мин. На следующий день добавьте все 100 миллилитров ночной культуры в 900 миллилитров предварительно разогретого бульона и инкубировать колбу в течение четырех-пяти часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании.
После инкубации гранулы культуры в 6000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 250 миллилитров стерильной воды. Повторите центрифугу и отбросьте супернатант.
Затем повторно посовестите гранулы в 250 миллилитров одного миллимолярского литиевого ацетата. Пеллет культуры центрифугации, удалить ацетат лития, и повторно гранулы в 9,6 миллилитров 50%PEG 3350. Затем добавьте реагенты преобразования, описанные в рукописи, и отрегулируйте громкость до 15 миллилитров со стерильной водой, аккуратно переверкуемой для смешивания.
Инкубировать смесь при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров DMSO и инкубировать в водяной бане при 42 градусах по Цельсию еще 30 минут. Добавление DMSO до теплового удара имеет решающее значение для достижения высокой эффективности трансформации.
После инкубации, гранулы дрожжей центрифугирование на 3000 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и промыть гранулы с 10 миллилитров стерильной воды затем повторить центрифугации гранул дрожжей. Переусейте гранулы в восьми миллилитров воды.
Определите эффективность преобразования путем разбавления образца от одного до 10 и покрытия 100 микролитров каждого разбавления на двойной выпадают агар. Затем пластины 200 микролитров образца на двойной отсева галактозы агар пластин и инкубировать пластины при 30 градусов по Цельсию в течение 48 до 96 часов или до тех пор, пока колонии появляются. После того, как колонии появились, патч их на двойной отсева галактозы агар и инкубировать их еще на 24 до 48 часов.
Используйте часть патча, чтобы привить пять миллилитров двойного выпадают бульона и инкубировать инокулум на ночь при 26 градусах по Цельсию со тряской при 150 об/мин. На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в пять колодцев пластины из 96 скважин, начиная с колодца А2. Vortex ночь культуры смеси. Добавьте 180 микролитров дрожжей в скважину А1 и последовательно разбавляйте его водой в колодцах А2 через А6. Пятно пять микролитров каждого разбавления на одной отсева глюкозы и одного отсева галактозы агар пластин убедившись, что включить токсичный эффектор только в качестве контроля.
Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 часов, а затем сравнить рост дрожжей с токсичным эффектором только для роста дрожжей с потенциальным супрессором. Чтобы подтвердить супрессоры, которые продемонстрировали снижение токсичности по сравнению с токсичным эффектором в одиночку, изолировать плазмид в соответствии с рукописными направлениями и вновь превратить его в токсичные дрожжи. Прививка двойного отсева глюкозного бульона с колонией из трансформационной пластины.
Инкубировать его на ночь и пятно на двойной отсева глюкозы и галактозы агар, чтобы подтвердить подавление токсичности. Перед выполнением дрожжевой супрессор экран, эффектор белков, представляющих интерес были протестированы на токсичность в дрожжах. Интерес к белку выражался в дрожжах под контролем неуязвимого промоутера галактозы, а рост галактозы сравнивали с ростом глюкозы.
Когда CT229 был протестирован на токсичность, небольшие колонии и подавление роста наблюдались. В идеале, два-три журнала снижение следует наблюдать, чтобы приступить к дрожжевой супрессор экранов. Экран супрессора был проведен путем преобразования токсичного штамма с дрожжевой геномной библиотекой pYAP 13 и покрытием трансформантов на галактозном агаре.
Полученные клоны супрессора были замечены на двойном выбросе галактозного агара для подтверждения подавления токсичности. Супрессоры pSup1 и pSup2 подавляли токсичность белка-эффектора, в то время как pSup3 - нет. Эти процедуры требуют тщательного внимания к деталям в дополнение к критическим подготовительным работам, включая наличие большого количества средств массовой информации и пластин, готовых до проведения эксперимента.
После того, как супрессоры определены, эксперименты могут быть выполнены для проверки взаимодействия с эффектором интереса, включая тянуть падения, иммунофторесценции колокализации, эффектор нокаутом или нокдаун принимающих факторов, выявленных на экранах. Разработка этого метода для эффекторов хламидиоза позволила ускорить предварительную характеристику белков-эффекторов и помогла сосредоточить наши усилия на выяснении основных молекулярных механизмов, которые являются посредниками взаимодействия патогенов-хозяйцев.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье описан метод идентификации путей хозяина, на которые направлены токсические бактериальные эффекторные белки, с использованием токсичности дрожжей и экранирующих исследований. Понимание этих взаимодействий важно для решения проблемы молекулярного патогенеза внутриклеточных бактерий, таких как Chlamydia trachomatis.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Взаимодействия патоген-хозяин
- Клеточная биология
Фон
- Бактериальные патогены выделяют эффекторные белки, которые манипулируют биологическими путями хозяина.
- Идентификация этих путей важна для понимания заболеваний, вызываемых внутриклеточными бактериями.
- Модели дрожжей могут использоваться для исследования влияния этих эффекторных белков.
- Этот метод был применен к различным патогенам, включая Chlamydia trachomatis.
Цель исследования
- Разъяснить пути хозяина, на которые направлены токсические бактериальные эффекторные белки.
- Предоставить представление о молекулярных механизмах патогенеза.
- Демонстрировать полезность экранирующих исследований токсичности дрожжей в этой области исследований.
Используемые методы
- Инокуляция дрожжей, трансформированных плазмидами эффекторных белков.
- Использование отрицательных контролей с дрожжами, трансформированными только вектором.
- Инкубация культур при 30 градусах Цельсия с колбанием.
- Анализ роста дрожжей и их токсичности для идентификации взаимодействий эффекторных белков.
Основные результаты
- Успешное определение путей хозяина, на которые направлены эффекторные белки Chlamydia trachomatis.
- Демонстрация эффективности исследований дрожжей в изучении бактериальных эффекторов.
- Взгляд на биологические цели различных внутриклеточных бактериальных патогенов.
- Потенциальные применения этого метода для других внутриклеточных бактерий.
Выводы
- Исследования токсичности и экранирующих исследований дрожжей являются ценными инструментами для изучения бактериальных эффекторных белков.
- Этот подход усиливает понимание взаимодействий патоген-хозяин.
- Дальнейшие исследования, использующие этот метод, могут привести к новым терапевтическим стратегиям против бактериальных инфекций.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
