Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Представлено здесь протокол для всего монтажа на месте РНК гибридизации анализа в зебрафиш и трубки формирования анализа в пациента полученных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток для изучения роли эндоглина в сосудистой формирования.

Вся гора, на месте гибридизации, WISH, обеспечивает высокое разрешение и низкий фоновый результат по сравнению с традиционными методами. Кроме того, U-слайд пластины улучшить фокус в том же фокусе, используя меньше WISH могут быть применены к эмбрионам мыши, Drosophila эмбрионов и других тканей трудно справиться. Анализ образования трубки может быть применен к стволовым клеткам дифференцированных клеток андрогенов.

WISH упрощает понимание функционального значения коррекции мутаций. Человек, который продемонстрирует процедуру, это Ен Ван, научный сотрудник из моей лаборатории. Работая под микроскопом, используйте систему FemtoJet для введения двух нанограммов морфолинов и 500 пикограмм MRNA в одноклеточные эмбрионы.

Практика микроинъекции Morpholinos много раз, пока вы не можете ввести его в клетки успешно и сохранить целостность яиц. Инкубировать зиготы, пока они не дехорионированы и достичь состояния развития, которое соответствует намеченного эксперимента. Как описано в таблице одной из рукописей.

Затем используйте пластиковую пипетку для переноса от 20 до 40 эмбрионов в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр свежеприготовленного раствора 4%PFA при комнатной температуре. После фиксации, мытья и обезвоживания эмбрионов, как описано в рукописи, поместите эмбрионы в сито с нейлоновой сеткой в нижней части.

Гидратировать эмбрионы последовательно мыть их в 75%50%и 25%метанола в течение пяти минут каждый. После мытья эмбрионов с PBST, добавить 50 микролитров протеиназы K в трубку с эмбрионами. После пищеварения, удалить протеиназу K и мыть эмбрионы с PBST три раза в течение пяти минут каждый раз.

Добавьте от 50 до 100 микролитров смешанных целевых зондов в каждую трубку с эмбрионами. Инкубировать эмбрионы на ночь при 40 градусах по Цельсию. После мытья эмбрионов, как описано в рукописи, используйте 4%paraformaldehyde, чтобы исправить эмбрионы в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем мыть эмбрионы в 2x SSCT раствор три раза в течение 15 минут каждый раз при комнатной температуре. Удалите решение SSCT и замените его 50 микролитров Amp 1. Затем инкубировать эмбрионы при 40 градусах по Цельсию.

Через 30 минут мыть эмбрионы в 2x SSCT раствор три раза в течение 15 минут каждый раз при комнатной температуре. Удалите решение SSCT и добавьте 50 микролитров Amp 2. После инкубации в течение 15 минут и мытья эмбриона, как это было сделано ранее, добавить 50 микролитров Amp 3 и нажмите трубку осторожно.

Инкубировать эмбрионы при 40 градусах по Цельсию. Через 30 минут мыть эмбрионы, как описано ранее. Затем добавьте 50 микролитров Amp 4 dropwise и осторожно коснитесь трубки.

Затем инкубировать эмбрионы при 40 градусах по Цельсию в течение 15 минут и мыть их три раза с SSCT. После подготовки эмбрионов для визуализации, как описано в рукописи, используйте комплект субстрата DAB peroxidase, чтобы испачкать образец. Добавьте 50 микролитров каждого из цветных реагентов A, B и C в один миллилитр дистиллированной воды.

И хорошо перемешать, чтобы получить полную рабочую жидкость DAB. Добавить жидкость в образец и накрыть в течение десяти минут. После тщательного мытья образцов, используйте оптический микроскоп, чтобы изучить их.

Чтобы начать культивирование и контроль HHT iPSCs, добавьте мембранную матрицу подвала к шести хорошо клеточным пластинам культуры, чтобы покрыть дно колодцев. Инкубировать пластины в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Затем удалите из колодцев использованный раствор мембранной матрицы подвала и добавьте в каждую скважину два миллилитров среды mTeSR 1.

Затем пластины iPSCs собраны из последнего прохода примерно в один раз десять до шести клеток на колодец. После культивирования iPSCs в течение примерно четырех дней, обмен клеточной культуры среды с дополненной среде BEL. Выращиваем клетки в течение трех дней, чтобы генерировать мезодермальные клетки.

Для расширения сосудистых эндотелиальных клеток, заменить средний с дополнительной bel среды в течение четырех дней. А затем лечить клетки с той же среде и культуры в течение еще трех-четырех дней. Очистить зрелые сосудистые эндотелиальные клетки с помощью CD31 Dynabeads в соответствии с инструкциями комплекта.

Затем соберите положительные ячейки CD31 с помощью буфера elution. Поддержание и расширение очищенных эндотелиальных клеток в среде EC-SFM, содержащей VEGF165, bFGF и FBS. Чтобы пластины эндотелиальных клеток, начните с добавления 10 микролитров мембранной матрицы подвала на колодец в ангиогенез пластин.

Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Урожай эндотелиальных клеток и повторно использовать их в эндотелиальной среды роста 2 путем трубопроводов неоднократно. Добавьте 50 микролитров этой клеточной подвески в затвердевую матрицу в каждом хорошо, а затем инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию.

После трех-пяти часов инкубации используйте микроскоп высокого разрешения для оценки образования эндотелиальных труб. Захват изображений по крайней мере десяти областей для каждой группы. Осмотрите общую длину трубки, номер трубки и точки ветки.

CISH и WISH были выполнены для определения экспрессии эндоглина в 24-часовых эмбрионах после оплодотворения. Гемогенный эндотелиальный маркер и эндотелиальный маркер прародителя были использованы для изучения эффекта замалчивания эндоглина. Красные стрелки указывают на области, где выражение этих маркеров, aplnrna и npr1a, значительно снизилась.

Анализ формирования эндотелиальной трубки проводился на эндоглиновых мутантах и контролировал эндотелиальные клетки, полученные из iPSC. Формирование труб было оценено и сфотографировано через три часа. Длина трубки, номер трубки и ветвление были количественно определены с помощью программного обеспечения ImageJ.

Мутантные эндотелиальные клетки образуют меньше ветвей, чем контролируют эндотелиальные клетки. А ветви в мутантных эндотелиальных клетках значительно увеличились после стимуляции с сосудистым эндотелиальным фактором роста. Этот метод также может быть использован для генерации iPS из периферической крови.

А методом уточняется роль эндокринной системы в сосудистом образовании in vitro и in vivo. Зная, что исправление мутации может изменить ангиогенез, можно пересадить клетки обратно в пациентов для потенциальной терапии стволовыми клетками.