Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids

Этот протокол полезен для энтероидной изоляции в культуре в дополнение к расследованию пролиферации клеток и выживания в энтероидах. Ученые могут применять этот метод для культуры энтероидов и для изучения влияния наркотиков и воспалительных цитокинов на кишечные эпителиальные клетки in vitro. Последствия этого метода распространяются на водную терапию воспалительных заболеваний кишечника.

Мы применяем этот метод, чтобы найти некоторые терапевтические цитокины. Этот метод дает представление о кишечной эпителиальной пролиферации и выживания; кроме того, он также может быть использован в органоидов, культурных вокруг тканей, кроме кишечника. Чтобы изолировать кишечные склепы и выполнить энтероидной культуры, использовать ткани миппы и найти ножницы радужной оболочки, чтобы вскрыть примерно восемь сантиметров илея от усыпляется восемь недель дикий тип мыши.

Используйте шприц с иглой для кормления гаважа, чтобы промыть илеум с около 40 миллилитров ледяной Dulbecco в фосфат-buffered солевой, а затем вырезать вдоль ножницами и открыть илеум. Разрежьте илеум на мелкие кусочки и поместите их на пять миллилитров стерильных ледяных DPBS в 15 миллилитров конической трубки. Затем раскачивать образец в течение пяти минут на льду.

Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать DPBS и заменить его на 10 миллилитров холодного буфера. После раскачивания в течение 30 минут на льду, используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать буфер один и заменить 10 миллилитров холодного буфера два. Затем встряхните в течение двух-трех минут вручную примерно при 80 коктейлях в минуту.

После встряхивания, проинспектировать двадцать микро-литровую каплю буфера два содержимого под микроскопом, чтобы обеспечить Есть склепы с гранулированными клетками Панет. Фильтр буфера два содержимого с 70 микрон стерильных клеток ситечко и собирать фильтрованный буфер в 50 миллилитров конической трубки. Pipette 20 микролитров фильтрата на слайде, чтобы подсчитать склепы.

Передача достаточного объема отфильтрованного буфера два содержимого, чтобы убедиться, что Есть около 500 склепов на колодец. Спин вниз при 150 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, а затем тщательно аспирировать супернатант. Перепроходить склепы в 50 микролитров мембранной матрицы подвала на 500 склепов.

Pipette вверх и вниз, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Поместите 50 микролитров капли мембранной матрицы подвала и склеп смеси в центре одного колодец из 24 хорошо пластины. Инкубация в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия для полимеризации мембранной матрицы подвала.

После 30 минут полимеризации, тщательно добавьте 600 микролитров минигут-медиа к каждой хорошо. Вернуть пластину в 37 градусов по Цельсию инкубатор, и наблюдать под микроскопом каждый день, меняя средства массовой информации каждые два-три дня. Чтобы пройти энтероиды, поместите пластину культуры тканей на лед, аспирировать средства массовой информации, и добавить один миллилитр холодного DPBS к каждому хорошо.

Используйте наконечник P1000 для пипетки вверх и вниз, пока не останется никаких матричных кусков. Перейдите образец через один миллилитр инсулина шприц и вниз в 15 миллилитров конической трубки. После вращения вниз в течение пяти минут при 150 раз G и четыре градуса по Цельсию, используйте пипетки для удаления DPBS.

Повторно приостанавливать энтероиды в 50 микролитров мембранной матрицы подвала на колодец. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы позволить матрице мембраны подвала полимеризировать. Затем наложить каждый колодец с 600 микролитров ENR-медиа и вернуть пластину в инкубатор.

Выращивайте энтероиды в течение пяти-семи дней, прежде чем передать их в новую пластину 24 хорошо, используя коэффициент расщепления один к двум. Добавьте 600 микролитров среды ENR к каждой хорошо, а затем инкубировать энтероиды в течение четырех-пяти дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Настройка контрольной группы необработанных энтероидов и экспериментальной группы энтероидов, обработанных пятью нанограммами на миллилитр интерлейкина-22.

Подготовь по крайней мере три репликации для каждой группы. Добавьте 600 микролитров среды EdU к каждой хорошо энтероидов, за исключением одного хорошо использовать в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания. Инкубировать пластину в течение двух часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.

Для сбора энтероидов из мембранной матрицы подвала используйте контроллер пипетки для аспирации среды EdU и вымойте один раз с помощью DPBS. Затем добавьте один миллилитр DPBS. Используйте P1000 пипетки отзыв пипетки вверх и вниз, пока не твердые мембраны мембраны куски остаются.

Перенесите образец в 15-миллилитровую трубку и вращайте вниз при 300 раз G в течение пяти минут, прежде чем сбросить супернатант. Добавьте 500 микролитров ферментов диссоциации клеток и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах цельсия. Затем используйте наконечник пипетки P200 для пипетки вверх и вниз и разбить энтероиды на одиночные клетки.

Далее добавьте три миллилитров модифицированного орлиного медиума Dulbecco, содержащего 10%fetal бычьей сыворотки, и неоднократно пипетку с наконечником пипетки P1000. После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, и аспирации супернатанта, мы приостанавливаем клетки в один миллилитр DPBS. Для выполнения фиксации и пермеабилизации клеток сначала перенесите подвеску клетки в одну точку пятими миллилитровую трубку, вращайте вниз при 300 Г в течение пяти минут и отбрасывайте супернатант.

Мы приостанавливаем клетки в один миллилитр 4%paraformaldehyde и исправить в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, аспирировать супернатант с наконечником пипетки. Вымойте клетки один раз с DPBS, и спина вниз снова, чтобы удалить супернатант.

Resuspend клетки с одним миллилитром 0.5%non-ionic surfactant, и инкубируют на 10 минут на комнатной температуре перед мытьем клеток с DPBS как раньше. Чтобы обнаружить EdU, добавьте 100 микролитров реакционной коктейля в каждую 1,5 миллилитровую трубку. Повторное течение клеток, и защитить их от света, инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.

После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, осторожно аспирировать раствор реакции с наконечником пипетки Добавить 0,5%non-ionic surfactant пенетрант для каждой трубки, чтобы вымыть один раз при комнатной температуре. После центрифугации, как и прежде, мы приостанавливаем клетки в один миллилитр DPBS. Фильтровать повторно начерщенные клетки с 40 микрон ситечко и собирать фильтрованные клетки в 15 миллилитров конической трубки.

Выполните факты по обнаружению машины как можно скорее. Выберите соответствующий канал и напряжение для анализа цитометрии потока. Для стратегии gating нарисуйте участок псевдоцвета FSC-A против SSC-A и распределите большую часть ячеек в видимый диапазон точечной карты, регулируя напряжение.

Выберите популяцию ячейки в качестве R1 и исключите клеточный мусор в левом нижнем углу. Из популяции ячеек R1 создать FSC-A против FSC-H псевдоцветный сюжет. Установите ворота, чтобы выбрать одиночные ячейки, обозначенные как R2, и исключить скопления клеток.

Из популяции клеток R2 установите интенсивность флуоресценции по сравнению с участком числа клеток и используйте отрицательный контроль для установления ворот. Область флуоресцентного сигнала является положительной клеточной областью, обозначенной R3.Сравните соотношение этих положительных клеток EdU между экспериментальными и контрольными группами. Небольшие кишечные склепы были изолированы и выучены как энтероиды в мембранной матрице подвала.

Энтероиды начали образовывать почки через два дня после изоляции. На шестой день у энтероидов было много почек с большим количеством мусора в люмене. Энтероиды были готовы к прохождению на данном этапе.

Энтероиды лечились ИЛ-22 в течение 3 дней, после чего синтетическая ДНК была помечена Эду красным цветом, чтобы указать на пролиферацию клеток. ИЛ-22 обработанных энтероидов отображается увеличение числа Эду положительных клеток. IL-22 увеличил размножающиеся клетки с 40,1% до 83,5%, как анализируется цитометрией потока.

Лечение ИЛ-22 также увеличило гибель клеток в энтероидах, о чем свидетельствует окрашивание йодида пропидия в красный цвет. IL-22 увеличил мертвые клетки с 4,9% до 16,2%, как анализируется цитометрией потока. Во время склепа изоляции прогресс справедливой встряхивания необходимо после добавления буфера для обеспечения достаточного количества склепов сотрясаются.

Мы советуем проверять содержимое под микроскопом. После этой процедуры, мы также можем количественно дифференцированных типов эпителий и энтероидов с помощью конкретных Этот метод поможет исследователям исследовать кишечной эпителиальной дифференциации в энтероидов. После своего развития этот вопрос прокладывает путь для исследователей в области гастроэнтерологии для изучения развития или патологических вопросов в разрезе.