Изображение Dpp Релиз из drosophila крыла диска
30 октября 2019 г.
Сроки воздействия лигандов могут повлиять на их последствия для развития. Здесь мы покажем, как изображение выпуска drosophila кости морфогенетического белка (BMP) называется Dpp из клеток крыла диска.
DPP влияет на судьбу клеток, связывая рецепторы и посылая сигнал внутриклеточно влиять на транскрипцию. Если DPP производится, но не выпущен, он не имеет доступа к рецепторам и, следовательно, не может выполнять свои роли. Этот метод позволяет визуализировать выпуск DPP, что позволяет исследователям изучить, какие генетические и экологические факторы меняют динамику выпуска DPP.
Сигнальный путь БМП сохраняется от мух к человеку, поэтому мы ожидаем, что механизм, который диктует выпуск DPP, также будет актуален для развития и регенерации человека. Начните с пересечения от 30 до 40 девственных женщин DPP GAL4 летает с 10 до 15 мужчин UAS DPP-GFP мух. Поощряйте укладку яиц, добавляя небольшое количество дрожжевой пасты в свежий флакон пищи.
Чтобы собрать яйца, переверните скрещенных мух во флакон и дайте им отложить в течение трех-четырех часов, прежде чем удалить их. Держите флаконы сбора яиц на 25 градусов по Цельсию в течение примерно 144 часов, пока личинки находятся на третьей стадии instar. Затем выберите соответствующие личинки для вскрытия.
Во-первых, выбрать личинки, которые не являются ТБ, которые будут нормальной длины, а не короткие и толстые. Чтобы выбрать DPP-GFP, выражаюющий личинки, просмотрите их под стерео микроскопом флуоресценции. Все личинки, не противотуберкулезные, будут иметь некоторую флуоресценцию, но GFP ограничен дисками крыла и менее яркий на личинках DPP-GFP.
Подготовьте модифицированные средства массовой информации HL3 в соответствии с рукописными указаниями, которые будут поддерживать живую визуализацию дисков крыла. Отрегулируйте рН до 7,1 с помощью HEPES, затем отфильтруйте его через фильтр 0,22 микрометра. Поместите два куска бесцветной двусторонний ширины ленты мудрым через слайд микроскоп оставив пространство около пяти миллиметров между ними и убедившись, что концы ленты лежат покраснел с краями слайда.
Используйте плоский край, чтобы прижимать ленту твердо к слайду. Добавьте 25 микролитров модифицированных HL3-медиа между двумя частями ленты. Когда диск крыла установлен в средствах массовой информации, куски ленты будет предотвратить его от дробленая обложка.
Чтобы вскрыть личинку, поместите ее в модифицированные HL3-средства и аккуратно разорвите пополам, используя две пары типсов. Отбросьте заднюю половину, а затем схватить середину передней половины с одной парой типсов и использовать другую пару, чтобы подтолкнуть рот крючки обратно в личинку, пока она полностью инвертирована. Ищите острые изгибы в двух темных цветных первичных ветвях трахеи, которые бегут по обе стороны личинки.
Диски крыла лежат прямо под ним. Аккуратно удалите диски и поместите их в HL3-медиа на подготовленном слайде, убедившись, что к дискам все еще не прикреплены кусочки трахеи. Упорядочить крыла диски так, что периподиальная сторона крыла мешок сталкивается вверх с диском лежал плоский.
Обложка крыло с крышкой и печать с лаком для ногтей. После того, как польский сухой, немедленно приступить к визуализации. Изображение установленного диска крыла с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с целью 40X нефти и 488 нанометрового лазера.
Сбор изображений со скоростью двух герц в течение двух минут. Для получения наилучших результатов, установить мощность лазера достаточно сильны, чтобы получить четкое изображение DPP-выпускающих клеток, чтобы избежать более отбеливания. Соберите изображения в серии времени и экспортировать их в качестве файлов AVI для получения видео релиза DPP.
Когда протокол успешен, DPP-GFP появляется как полоса вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги. Выпуск DPP-GFP виден как флуоресцентная панкта, которая появляется и исчезает как внутри, так и далеко от тел клеток. Различные панкты, вероятно, в цитономах или в цитономе синапсах.
Диски крыла монтируются таким образом, чтобы изображение было сделано с периподиальной стороны. Если диск крыла изображен с обратной стороны, флуоресценция DPP-GFP будет выглядеть не в фокусе, а разрешение будет плохим. Когда GFP не сливается с DPP, нет puncta за пределами клеток органов не наблюдается.
Этот элемент управления показывает, что DPP-GFP ведет себя иначе, чем GFP в одиночку. Кроме того, нет флуоресцентных puncta появляются, когда DPP-GFP не выражается. Во время этой процедуры важно, чтобы диск крыла был установлен периподиальной стороной вверх.
Если диск крыла неправильно ориентирован, DPP-GFP появится вне фокуса. Этот метод может быть использован для изучения выпуска других развития сигнализации лиганды, как бескрылый или еж. Мы можем исследовать все различные экологические и генетические факторы, которые могут повлиять на выпуск DPP.
Кроме того, мы можем адаптировать этот метод для изучения BMP-релиза от других типов клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается динамика высвобождения костного морфогенетического белка (BMP) Dpp у Drosophila, при этом особое внимание уделяется тому, как время воздействия влияет на результаты развития. Разработанный метод позволяет визуализировать высвобождение Dpp, что дает представление о генетических и средовых факторах, влияющих на этот процесс.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Клеточная сигнализация
Теоретические сведения
- Dpp влияет на судьбу клеток, связываясь с рецепторами и запуская внутриклеточную передачу сигнала.
- Без высвобождения Dpp не может взаимодействовать со своими рецепторами и выполнять свои функции.
- В данном исследовании используются методы визуализации для наблюдения за высвобождением Dpp.
- Сигнальный путь BMP эволюционно консервативен, что указывает на его значимость для биологии человека.
Цель исследования
- Визуализация высвобождения Dpp из клеток имагинального диска крыла.
- Изучение влияния генетических и средовых факторов на динамику высвобождения Dpp.
- Понимание значения высвобождения Dpp для процессов развития и регенерации.
Используемые методы
- Скрещивание мух DPP GAL4 с мухами UAS DPP-GFP.
- Стимуляция откладки яиц с помощью дрожжевой пасты.
- Методы визуализации для наблюдения за высвобождением Dpp.
- Анализ генетических и средовых факторов, влияющих на динамику высвобождения.
Основные результаты
- В исследовании успешно визуализировано высвобождение Dpp из клеток.
- Определены ключевые факторы, влияющие на динамику высвобождения Dpp.
- Продемонстрирована консервативность сигнальных путей BMP.
- Получены данные, имеющие значение для понимания развития и регенерации человека.
Выводы
- Понимание механизмов высвобождения Dpp имеет решающее значение для изучения процессов развития.
- Полученные результаты могут иметь значение для регенеративной медицины.
- Будущие исследования могут опираться на эти методы для изучения других BMP.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Визуализация динамики высвобождения лиганда восполняет критический пробел в валидации мишени, позволяя напрямую наблюдать за доступностью сигнальных молекул, что необходимо для оценки обоснованности терапевтической гипотезы. Этот метод способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска, проясняя, способен ли лиганд взаимодействовать со своим рецептором в биологически значимом контексте. Данный подход повышает прогностическую достоверность стратегий модуляции путей, особенно для консервативных сигнальных сетей, таких как BMP/TGF-β.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать высвобождение лиганда как необходимое условие для взаимодействия с рецептором и передачи сигнала.
- Практическая ценность: обеспечивает прямой мониторинг доступности лиганда, что снижает неопределенность в понимании механизма действия мишени.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков, подтверждая, что генетические или средовые воздействия влияют на доступность лиганда, а не только на его экспрессию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать количественно определяемые флуоресцентные пункты в качестве индикатора событий высвобождения, что обеспечивает возможность сравнительного скрининга генетических или химических модуляторов.
- Практическая ценность: использование стандартизированных протоколов диссекции и монтажа гарантирует воспроизводимость условий визуализации в различных экспериментах.
- Научная ценность: получение данных с временным разрешением, которые могут быть сопоставлены с состояниями активации путей для оптимизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Использование эволюционной консервативности сигналинга BMP для формулирования гипотез о механизмах высвобождения лигандов у человека в процессах развития и регенерации.
- Практическая ценность: Возможность адаптации метода для других лигандов развития (например, Wingless, Hedgehog), что расширяет область применения для различных классов сигнальных путей.
- Научная ценность: Возможность изучения высвобождения лигандов в системах, имеющих значение для патологий, путем установления связи между клеточной динамикой и фенотипическими результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий, обеспечивая валидацию функциональности лиганда на ранней стадии, перед инвестированием ресурсов в последующий скрининг или оптимизацию ведущих соединений.
- Открывающая биология: Позволяет проверить гипотезу о том, что лиганд не только экспрессируется, но также высвобождается и доступен для связывания с рецептором.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных данных таймлапс-визуализации, подходящих для высококонтентного анализа кинетики высвобождения при различных условиях.
- Аналитика: Позволяет генерировать измеряемые показатели (частота, распределение и длительность появления флуоресцентных пунктат), что обеспечивает возможность статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: Устанавливают связь между динамикой высвобождения лиганда и фенотипами развития, что позволяет экстраполировать полученные данные на биологию человека благодаря консервативности сигнальных путей.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу визуализации для изучения механизмов высвобождения различных сигнальных лигандов в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени путем подтверждения доступности лиганда — ключевого этапа, который зачастую предполагается, а не измеряется непосредственно.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизации подготовки образцов и контроля их ориентации (периподиальной стороной вверх).
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем фильтрации мишеней на основе функциональной доступности лигандов, а не только уровней их экспрессии.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков, выбирая те, лиганды которых демонстрируют регулируемое высвобождение в соответствующих тканях.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области генетики Drosophila, проведения диссекции и флуоресцентной микроскопии.
- Для оптимального детектирования сигнала необходима конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с использованием масляного объектива 40X и лазера с длиной волны 488 nm.
- Для поддержания жизнеспособности тканей во время визуализации требуется стандартизированное приготовление сред (модифицированная среда HL3, pH 7.1, с HEPES-буфером, фильтрованная).
- Для предотвращения артефактов фокальной плоскости и обеспечения воспроизводимости результатов требуется строго определенная ориентация образца (диск крыла периподиальной стороной вверх).
- Метод ограничен визуализацией тканей ex vivo; не применим к целым организмам или высокопроизводительному скринингу живых животных.
