Количественная оценка прижатки опухолевых клеток в криосекциях лимфатических узлов

Наиболее частыми местами метастазирования являются оригинальные лимфатические узлы. Соматиды могут быть использованы для обнаружения клея сродство между опухолевыми клетками'лимфатических узлов разделов в пробирке. Одним из преимуществ этого метода является то, что свежие секции лимфатических узлов обеспечивают естественную сложность оригинальной ткани, которую невозможно воссоздать с помощью очищенных белков.

Этот метод может быть полезен для молекулярной онкологии исследований, которые направлены на выявление генов или методов лечения, которые мешают опухолевых клеток'adhesion на метастатические целевые органы, как лимфатические узлы. Чтобы собрать лимфатические узлы в течение тридцати минут после жертвоприношения, поместите взрослую крысу Wistar в спинную лежачесть на чистую доску для вскрытия при комнатной температуре и распылите мех 70%изопропиловым спиртом. Используя стерилизованные инструменты, поднимите кожу живота и сделайте медиальный разрез кожи, чтобы разоблачить брюшной внутренности.

Извлекайте кишечник до тех пор, пока не станут видны грудные и брюшные лимфатические узлы. Используя ножницы с тупым наконечником, тщательно подакцизировать лимфатические узлы, не повреждая основную вышестоящую мезентерическую артерию, и поместить лимфатический узел в 15 мл трубки, содержащей 5 мл стерильной PBS. Когда все лимфатические узлы были собраны, место один лимфатический узел на криомольд лицом вниз на базе каждой формы и добавить достаточно оптимальной среды резки температуры для покрытия тканей.

После замораживания оснастки, используйте криостат, чтобы приобрести от 5 до 8 микрометров толщиной разделов при 22 градусах по Цельсию и собирать разделы на стеклянный микроскоп слайды. Хорошее качество cryosections от последовательных ломтиков одного и того же лимфатического узла имеют решающее значение для минимизации различий между ломтиками, и содействие последовательной клеточной адгезии ставки. Для маркировки опухолевых клеток, урожай клеток, представляющих интерес из надлежащим образом поставил клеточной культуры и повторно приостановить клетки на 1 х 10 до 6 клеток на мЛ концентрации и сыворотки свободной среды.

Передача 1 мл клеток в новую коническую трубку 15 мл и этикетки клеток с 2 микрограмм на мл DiI (C18) в течение десяти минут при 37 градусов по Цельсию, с нежным возбуждением в пять минут, чтобы избежать осаждения клеток. В конце инкубации гранулы клеток центрифугации и мыть помеченные клетки два раза с 10 мл свежей сыворотки свободной среде, чтобы удалить излишки красителя. После второй стирки, повторно приостановить клетки на 1 х 10 до 6 клеток на мл сыворотки свободной среды, дополняется 0,1% бычьей сыворотки альбумин концентрации.

Продолжая помеченные опухолевые клетки на собранные лимфатические узлы ткани разделов, аккуратно мыть разделы два раза в PBS, а затем регидратации в свежем PBS в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. В конце инкубации, блокировать любые неспецифические связывания с 2,5%бычьего альбумин сыворотки в течение тридцати минут при 37 градусов по Цельсию, прежде чем использовать ватный тампон, чтобы высушить слайды. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать барьер вокруг каждого раздела и добавить 100 микролитров помеченных клеток на каждый окруженный лимфатический узел.

После одного-двух часов при температуре 37 градусов по Цельсию во влажной камере, удалить любые клетки несоблюдения с четырьмя нежными моет в PBS и исправить оставшиеся клетки флуоресценции приверженец с 3,7%формальдегида в PBS в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Для количественной оценки клеевых индексов используйте цель 10x на флуоресцентном микроскопе для получения отдельных изображений TIFF каждого участка в ярких и красных флуоресцентных полях. Затем, имя и сохранить изображения систематически, прежде чем открыть изображения на Фиджи.

После установки шкалы используйте полигональный инструмент для выбора области, которая представляет интерес для количественной оценки. Выберите для количественной оценки области лимфатических узлов. Данные будут выражены в квадратных миллиметрах.

Далее выберите Плагины, Анализ, Счетчик ячеек и нажмите на фотографию, чтобы быть количественно. Нажмите Инициализировать и выберите Counter Type. Затем нажмите на ячейки на фото.

Индекс адгезии лимфатических узлов будет выражен как количество адептовых опухолевых клеток на область, покрытую лимфатическим узлом. Чтобы инициализировать следующую фотографию, откройте следующую фотографию и повторите количественную оценку, как попродемонстрировано. Как отмечается, морфология клеток-адептов округляется по форме, а клетки неоднородно рассредоточены по всему лимфатическому узлу, представляющим интерес.

Индекс адгезии лимфатических узлов в два-три раза выше в NDRG4 отрицательных линий клеток рака молочной железы, по сравнению с измеренным для соответствующих положительных клеток NDRG4. Эта процедура может быть адаптирована для оказания помощи адгезии ставки в других метастатической ткани цели, как мозг или легкие, для оценки вторичных преференциальных участков адгезии для оплодотворенных опухолевых клеток. Помните, что как свежие, так и замороженные ткани следует считать биологически случайными и должны обрабатываться с использованием соответствующих мер биобезопасности.