Протоколы 3D биопечати желатина Methacryloyl Гидрогель на основе биоинков
21 декабря 2019 г.
Здесь представлен метод 3D-биопечати желатина метакрилоила.
Бионика на основе гидрогеля GelMA становится очень популярной в 3D биопечати. Однако низкая вязкость ограничивает его печатаемость. Здесь мы делимся стратегиями печати GelMA в нашей лаборатории с другими исследователями.
В этом видео мы полностью используем специальные свойства этого биоматериала и предлагаем несколько методов печати для различных 3D структур, которые могли бы способствовать дальнейшему биомедицинскому применению. Возьмем, к примеру, повреждения органов, последствия могут быть использованы в соответствующей терапии путем встраивания или отслеживания печатных структур GelMA. Было бы нелегко полностью растворить лиофилизированный GelMA в течение короткого времени.
Для ускорения процесса растворения можно использовать вихревой смеситель. Каждый биоматериал будет использовать специальные свойства интимной GelMA. Я предложил новый chemer должны должным образом принять блуждать о том, что кондиционирования критических при печати.
Детали операции определяют успешное функционирование процедур печати. Именно поэтому мы выбираем визуальную демонстрацию, чтобы поделиться с другими исследователями. Для изготовления микросфер начните с соединения двух металлических электродов кольца с землей и положительными полюсами.
Поместите металлическую пластину, соединенную с высоким напряжением ниже кольцевого электрода, и чашку Петри с кремниевым маслом на металлическую пластину в качестве капельного приемника. Подготовка био-чернила путем растворения лиофилизированных GelMA и LAP и DPBS фильтр его через 0,22 микрометрового фильтра для бесплодия затем нагревать его в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут. Отсоедините клетки MDA-MB-231 с тремя миллилитров 0,25 процента трипсина и 0,02 процента EDTA решение в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию.
Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугайте их 100 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и смешать клетки с одним миллилитр подготовленных био-чернила, медленно трубопроводов вверх и вниз убедившись, чтобы избежать пузырьков воздуха. Аспирировать один миллилитр био-чернила и клеточной смеси в три миллилитров стерильных шприца.
Кормите био-чернила силой сжатого воздуха и положите шприц на прибор. Включите высоковольтную мощность и установите напряжение от нуля до четырех киловольт. Одновременно включите 405 нанометровый свет длины волны, чтобы связать капли GelMA в пяти миллилитров кремниевого масла.
Декант петри блюдо, чтобы избавиться от большей части кремниевого масла и использовать ложку для передачи оставшегося масла и микросфер в 15 миллилитров центрифуги трубки. Добавить пять миллилитров DPBS и встряхнуть смесь центрифуги трубки в 100 раз G и удалить супернатант. Передача микросфер в чашку Петри с DMEM и культуры их при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа в течение трех дней.
Через три дня отбросьте среду и вымойте микросферы с помощью DPBS. Исправить их с двумя миллилитров из четырех процентов PFA в течение 30 минут при комнатной температуре затем отказаться от PFA и повторить мыть. Permeabilize клетки с двумя миллилитров 0,5 процента неионных сурфактант в течение пяти минут при комнатной температуре отказаться от сурфактанта и мыть микросферы с DPBS.
Следующее пятно клеток с TRITC-фаллоидин в течение 30 минут, то DAPI в течение 10 минут в темноте отбрасывая красители и мыть сферы с DPBS после каждого окрашивания. Изображение микросфер с конфокального флуоресцентного микроскопа. Растворите стерилизованный порошок альгината натрия в деионизированной воде при соотношении веса к объему в два процента.
Подготовка стерильных био-чернила раствор, как описано ранее, то тепло био-чернила и альгинат натрия в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут. Трипсинизировать и центрифуги bMSCs в соответствии с ранее описанной процедурой для MDA-MB 231 клетки затем удалить сверхнатантной жидкости и повторного перерасхода клеточных гранул с 2 миллилитров гелМА био-чернила. Аспирировать два миллилитров смеси био-чернил клеток в 10 миллилитров шприц и два миллилитров смеси альгината натрия в другой шприц.
Кормите растворы двумя шприц-насосами био-чернилами по 50 микрометров в минуту и альгинатом натрия на 350 микрометров в минуту. Включите 405 нанометровый свет длины волны, чтобы облучить прозрачную трубку и перевязать волокна GelMA. Используйте чашку Петри, чтобы получить волокна и собрать их с ложкой.
Перенесите волокна в блюдо с DMEM/F12 и культуры их в течение трех дней при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа. После культивирования клетки следуют ранее описанным направлениям для наблюдения волокон под конфокальные флуоресценции микроскопа. Растворите лиофилизированные GelMA и LAP и DPBS и добавьте пурпурный съедобный пигмент в раствор для повышения точности печати.
Фильтровать раствор через фильтр 0,22 микрометра для бесплодия и нагревать его в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут. Создайте 3D-модели с программным обеспечением CAD и импортируем модельные документы на верхнее программное обеспечение прикладного биопринтера DLP. Добавьте десять миллилитров подготовленных био-чернил в корыто биопринтера.
Установите параметры печати в соответствии с рукописными указаниями, затем начните печатать. После завершения удалить печатную структуру из биопринтера и погрузить его в DPBS в чашку Петри. Отсоединеть и гранулы MDA-MB 231 клеток, как описано ранее.
Переусейте их двумя миллилитров DMEM и добавьте подвеску в печатную структуру. Культура клеток на 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа в течение трех дней, то подготовить структуры для наблюдения с конфокального флуоресценции микроскопа, как описано ранее. Подготовьте 10-процентный вес к объему GelMA и 0,5 процента веса для громкости LAP решения затем отфильтровать его через фильтр 0,22 микрометра.
Стерилизовать желатиновый порошок под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут и добавить его в раствор GelMA LAP на пять процентов веса к объему отношения. Нагрейте смесь в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Заполните формы с подготовленными био-чернила и поместите их в четыре градуса по Цельсию холодильник в течение 30 минут.
Используйте лезвие, чтобы удалить частично связанные гидрогель листы из форм. Комбинат 2D формованных листов гидрогеля и связь их с GelMA путем облучения на 405 нанометров в течение одной минуты. Отсоединеть и гранулы HUVECs смешать клетки с двумя миллилитров DMEM и ввести подвеску в микроканал с соплом и шприцем.
В течение следующих трех часов переворачивать чип вверх дном каждые 15 минут для достижения равномерной и полной ячейки сидения. Культура чипсы в чашке Петри в течение трех дней в DMEM при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа затем подготовить их к морфологическим наблюдениям. Когда капли GelMA попали в принимающее силиконовое масло, они сохранили стандартную форму сфероида без хвостов.
Инкапсулированные клетки, испытывающие высоковольтную силу электрического поля, сохраняли свои возможности распространения, что проверяло биосовместимость метода производства с помощью электропривода. Биопринтер DLP был выбран для изготовления структур GelMA с более сложными формами, такими как ухо носа и многокамерная камера. Семена HUVECs прилагается к материалам GelMA и распространяется на поверхности перекрестных структур GelMA, демонстрируя, что это приложение имеет потенциал для тканевой инженерии.
Для изготовления микрофлюидных чипов на основе GelMA использовалась дважды кросс-связывающая стратегия. Чипы с различными микроканалами были построены путем проектирования различных форм по требованию и HUVECs были посеяны в каналах и прилагается к стене канала формирования макроскопической формы сосуда. При изготовлении микросфер применяется источник высокого напряжения.
Исследователи должны изучить цепи до и не прикасаться подвергаются миллибары защиты операторов или делает клетки от повреждения короткого замыкания. Ультразвуковой водной базы может быть еще одним выбором для ускорения достойной скорости. Определенно этот вклад обобщил 3D методы биопечати GelMA в нашей лаборатории.
Исследователи могли бы обратиться к видео и улучшить или расширить стратегии печати для обслуживания дальнейших биомедицинских требований.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод 3D-биопечати желатинметакрилоила (GelMA). Рассматриваются стратегии по улучшению пригодности GelMA к печати, что имеет решающее значение для различных биомедицинских приложений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- 3D-биопечать
- Биоматериалы
- Биомедицинская инженерия
Теоретические сведения
- Гидрогели GelMA становятся все более популярными в 3D-биопечати.
- Низкая вязкость GelMA ограничивает возможности его печати.
- Необходимы стратегии для улучшения его применения в биомедицинских областях.
- Потенциальные области применения включают терапию повреждений органов.
Цель исследования
- Поделиться эффективными стратегиями печати GelMA.
- Изучить особые свойства GelMA для создания различных 3D-структур.
- Внести вклад в развитие биомедицинских приложений.
Используемые методы
- Использование уникальных свойств GelMA.
- Разработка различных методов печати.
- Стратегии встраивания или трассировки напечатанных структур.
- Решение проблем, связанных с растворением лиофилизированного GelMA.
Основные результаты
- Продемонстрированы эффективные методы печати GelMA.
- Показаны потенциальные возможности применения в терапии.
- Выявлены проблемы, связанные с растворением GelMA.
- Представлены рекомендации для дальнейших исследований в области 3D-биопечати.
Выводы
- Улучшенные методы 3D-биопечати GelMA могут расширить возможности их применения в биомедицине.
- Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации пригодности GelMA к печати.
- Потенциал для внесения значительного вклада в терапию органов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
3D-биопечать гидрогелей GelMA позволяет создавать сложные структуры, содержащие клетки, для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине. В данном протоколе решаются проблемы пригодности к печати с помощью электроассистированного формирования капель, экструзии волокон и структурирования на основе DLP-технологии, что обеспечивает воспроизводимое изготовление микросфер, волокон и микрофлюидных чипов. Эти методы повышают прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая создание настраиваемых биосовместимых скаффолдов, имитирующих сигналы внеклеточного матрикса.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия между клетками и матриксом с помощью RGD- и MMP-чувствительных мотивов в GelMA, что способствует механистическому снижению рисков при определении терапевтических мишеней.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированные форматы микросфер и волокон для высокопроизводительного скрининга поведения клеток под воздействием контролируемых биофизических стимулов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание количественно оцениваемых 3D-микроокружений для анализа распластывания, жизнеспособности и морфогенеза клеток в ответ на фармакологические или генетические воздействия.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет использования составов GelMA с УФ-сшиванием, обладающих регулируемой жесткостью и скоростью деградации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает изготовление перфузируемых микрофлюидных чипов, выстланных HUVEC, что позволяет создавать васкуляризированные модели тканей для изучения транспорта лекарственных веществ и токсичности.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемое производство сложных 3D-архитектур (например, носа, уха, многокамерных структур) для доклинической валидации методов регенеративной терапии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс объединяет подготовку биочернил, инкапсуляцию клеток и сшивание под воздействием электрического напряжения или света для создания функциональных гидрогелевых конструкций, пригодных для последующей биологической оценки.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез об интегрин-опосредованной адгезии и протеаз-зависимом ремоделировании в 3D-контексте.
- Скрининг: позволяет воспроизводимо создавать гидрогелевые микросферы и волокна для стандартизированного скрининга соединений в физиологически релевантных 3D-матриксах.
- Аналитика: предоставляет данные структурного и флуоресцентного анализа (например, конфокальную визуализацию актина и ядер) для количественной оценки клеточных ответов при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает переход от фундаментальных открытий к доклинической работе путем создания васкуляризированных микрофлюидных чипов, моделирующих формирование и функцию микрососудов человека.
- Корпоративное повторное использование: создает модульную платформу, адаптируемую к различным типам клеток и геометрии, что сокращает затраты на повторную разработку в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Улучшает валидацию мишеней, обеспечивая возможность функциональной оценки клеток в биодеградируемых адгезивных гидрогелях, которые воспроизводят ключевые характеристики микроокружения.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированного состава биочернил, стерильной фильтрации и контролируемых параметров сшивания.
- Стратегическая ценность: Сокращает сроки снижения биологических рисков, предоставляя прогностические модели интеграции тканей и васкуляризации на ранних этапах.
- Влияние на портфель проектов: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении программ в области регенеративной медицины, позволяя быстро итерировать дизайн скаффолдов и взаимодействие клеток с материалом.
Особенности внедрения
- Требуются экспертные знания в области химии гидрогелей, приготовления стерильных биочернил, а также систем электрического или оптического сшивания.
- Необходимы приборы, включая источники питания высокого напряжения, шприцевые насосы, источники света с длиной волны 405 nm и DLP-биопринтеры.
- Требуется межкомандная стандартизация вязкости биочернил, плотности клеток и продолжительности сшивания для обеспечения воспроизводимости результатов между лабораториями.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных типов клеток (например, MDA-MB-231, bMSCs, HUVECs) и кинетику гелеобразования при разных концентрациях GelMA.
- Присутствуют практические ограничения, такие как низкая вязкость GelMA, что требует применения вспомогательных методов (например, электрогидродинамической печати, коэкструзии с альгинатом) для обеспечения точности формы.
