Анализ перемещения миокардной механической деформации (DIAMOND) показывает сегментную гетерогенность сердечной функции у эмбриональных зебрафиш
6 февраля 2020 г.
Целью данного протокола является детальный новый метод оценки сегментальной сердечной функции у эмбриональных зебры как в физиологических, так и в патологических условиях.
Diamond является первым методом с открытым исходным кодом для количественной оценки четырехмерной сегментальной сердечной функции эмбрионов зебры. Наш метод имеет разрешение микрометра, которое может количественно местной сердечной механики в 3D пространстве. Никакой другой текущий подход не позволяет этого.
Алмаз распутывает новые модели травмы в доксорубицин индуцированной сердечной токсичности. Таким образом, мы считаем, что наш метод может быть использован в качестве платформы для высокой пропускной способности in vivo скрининга для химиотерапии индуцированной сердечной токсичности. В настоящее время мы работаем над адаптацией Diamond к сердцу млекопитающих.
Тем не менее, дополнительная работа необходима для учета ориентации сердечной мышцы млекопитающих и вращательного и скручивания движения. При попытке этого метода, очень важно, чтобы пользователь имеет четкую визуализацию анатомической структуры сердца зебры, чтобы правильно определить горизонтальные и вертикальные оси и сегментировать желудочек. Чтобы реконструировать 3D систолическое и диастолическое сердце, начните с открытия папки, созданной алгоритмом постсинхронизации, а затем откройте папку вывода.
Найдите первую систолическую и диастолическую фазу и завестите номер кадра. Затем откройте выход по папке состояния и найдите папки, которые имеют те же числа, что и записанные номера кадров. Преобразуйте изображения в папке в 3D-файлы TIF и назовите их диастолом.
тиф и сизол.tif. Для выполнения сегментации желудочка откройте программное обеспечение для анализа изображений, нажав на файл и открытые данные. Затем загрузите диастол.
тиф и сизол. и введите размер voxel в соответствии с настройками изображения. Нажмите на панель сегментации и вручную сегментировать желудочка часть сердца с помощью встроенного инструмента порога.
Затем удалите атриовентрикулярный канал и отток тракта в сегментированный желудочек, потому что это повлияет на анализ смещения. После завершения сегментации нажмите на панель проекта, нажмите правой кнопкой diastole.labels. tif и systole.labels.
tif вкладок в консоли и нажмите экспортные данные, чтобы сохранить данные, как 3D TIF файлов. Открытая prepimage_1. m в среде программирования убедитесь, что папка InPath на строке 5 содержит исходные и сегментированные файлы TIF, и измените срез на живых четырех на количество срезов файлов 3D TIF.
После запуска кода будут созданы пять новых 3D-файлов TIF и две новые папки. Импорт всех пяти 3D файлов TIF в программное обеспечение для анализа изображений. Перейдите на многоплановую панель и выберите diastole_200.
tif в качестве первичных данных. Выровняйте х-ось с вертикальной длинной оси желудочка и z-оси с горизонтальной длинной оси желудочка. Далее выберите три случайные точки из косой плоскости Y' против часовой стрелки и завести их координаты 3D-позиции.
Повторите этот процесс для systole_200.tif. Нажмите на панель проекта и создайте объект среза для diastole_200. tif правой нажатием на diastole_200.
тиф и поиск объекта среза. Слева щелкните созданный объект среза, проверьте плоскость набора в вариантах панели свойств, выберите три точки в определении плоскости и введите ранее записанные координаты. Правого щелчка diastole_200.
tif, поиск блистательного преобразованного изображения и создания объекта. В панели свойств выберите срез в качестве ссылки и нажмите кнопку, которая должна генерировать объект под названием diastole_200.transformed. Далее, правой кнопкой diastole_200.
преобразуется, поиск повторного и создать объект. Выберите размер voxel в качестве режима и измените его на x равно одному, y равно одному, а z равен одному в панели свойств. Нажмите применить затем сохранить сгенерированный diastole_200.
повторной выборки объекта в качестве 3D-файла TIF. Повторите этот процесс для dialabel. Тиф, тест.
Тиф, systole_200. Тиф, сислабель. тиф, и тест.
тиф в соответствии с рукописными указаниями. Импорт всех шести повторно отлажённые файлы в ImageJ и выберите systole_200. resampled, в котором атриовентрикулярный канал четко визуализированы убедившись, чтобы записать количество ломтика.
Используйте функцию вращения преобразования изображения для вертикального положения атриовентрикулярного канала. Нанесите одно и то же вращение на все файлы, затем закройте все окна и сохраните изменения. Затем перемести systole_200.
resampled, сислабель. resampled, и test2. повторно отмахивался resample_sys папку.
Перемещение diastole_200. resampled, dialabel. resampled, и тест.
повторно отмахивался resample_dia папку. Открытая divider_2_8_pieces. м и изменить InPath в строке пять на изображение каталога.
Измените переменную середину в строке 22 на число срезов, где четко визуализирована атриовентрикулярный канал. Повторите этот процесс для diastole_200. resampled на линиях 394 и 411.
Запустите код. При запросе нажмите один раз на центр желудочка и на центр атриовентрикулярного канала. Чтобы зарегистрировать систолические и диастолические матрицы изображения, откройте register_3.
m и изменить InPath в строке четыре на путь папки изображения. Затем откройте displacement_4. m и изменить InPath на путь папки изображения.
Запустите программу для генерации вектора8. txt файл с матрицей 8 на 4. Каждый ряд матрицы содержит величину компонента x, y компонента, z компонента, а также суммарную величину вектора смещения определенного сегмента желудочка.
Эти значения могут быть переведены в электронную таблицу. Этот протокол был использован для выявления сегментной неоднородности сердечной функции и восприимчивости к доксорубицин-индуцированной травмы миокарда у зебры. После 24-часового лечения доксорубицином от трех до четырех после оплодотворения перемещение желудочковых сегментов сравнивали между контрольными и обработанными группами.
В условиях контроля, базальные сегменты один и шесть подвергаются наибольшему перемещению и являются наиболее восприимчивыми к доксорубицин-индуцированной сердечной травмы. При шести dpf средняя норма L2 сегментальных векторов смещения в контрольной рыбе колебалась от 3,9 до 8% после нормализации. Базальные сегменты один и шесть восстановленных Diamond смещения до уровня контроля предлагая сегментной регенерации.
Между тем, ухудшение 2D базального штамма от отрицательных 53 до отрицательных 38% наблюдалось сразу после лечения доксорубицином с последующим возвращением к контрольным уровням 48 часов спустя, подтверждающим результаты перемещения алмазов. Наблюдалось также параллельное снижение и восстановление глобальной фракции выброса или ЭФ в ответ на лечение. Алмаз затем применяется во время лечения доксорубицина и модуляции выемки пути с использованием ингибитора выемки DAPT и ниже по течению эффекторов NICD и NRG1 mRNA.
Микроинъекция мРНК спасла уменьшение смещения алмазов и EF после острой травмы, вызванной химиотерапией. Кроме того, ингибирование выемки пути после химиотерапии препятствовало восстановлению diamond смещения базальных сегментов и EF через 48 часов после лечения, но ингибирование было спасено выемкой вниз по течению эффекторов. Традиционная фракция выброса, как известно, является бесчувственным и запоздалым показателем травмы миокарда.
Алмаз позволяет исследователям количественно координационную сердечную функцию и помочь неоднородности в травмы миокарда в эмбрионах зебры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описывается новый открытый метод под названием Diamond для оценки сегментарной функции сердца у эмбрионов zebrafish. Он обеспечивает количественный анализ локальной механики сердца в 3D-пространстве с высоким разрешением, что позволяет идентифицировать паттерны повреждений при кардиотоксичности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Оценка сердечной функции
- Эмбриональные модели zebrafish
- Анализ патологических состояний
Теоретические основы
- Современные методы не позволяют оценивать локальную механику сердца в 3D.
- Кардиотоксичность, вызванная доксорубицином, является серьезной проблемой при проведении химиотерапии.
- Высокопроизводительный скрининг in vivo необходим для оценки кардиотоксичности.
- Адаптация методов для сердец млекопитающих является целью на будущее.
Цель исследования
- Представить новый метод оценки сердечной функции у эмбрионов zebrafish.
- Обеспечить количественную оценку механики сердца с микрометровым разрешением.
- Создать платформу для скрининга кардиотоксичности, индуцированной химиотерапией.
Используемые методы
- Разработка методов с открытым исходным кодом
- Количественная оценка сердечной функции
- 3D-пространственный анализ механики сердца
- Методы скрининга in vivo
Основные результаты
- Diamond обеспечивает беспрецедентное разрешение при оценке функции сердца.
- Выявлены новые паттерны повреждений, связанные с токсичностью доксорубицина.
- Продемонстрирован потенциал для применения в высокопроизводительном скрининге.
- Ведется работа по адаптации метода для сердец млекопитающих.
Выводы
- Diamond представляет собой значительный прогресс в оценке сердечной функции.
- Метод имеет потенциал применения для скрининга токсичности лекарственных препаратов.
- Необходимы дальнейшие исследования для адаптации метода для других видов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Современные методы анализа сердечной функции не обладают разрешением, достаточным для выявления сегментарной гетерогенности в моделях на ранних стадиях, что ограничивает понимание механизмов кардиотоксичности, вызванной соединениями. Метод DIAMOND позволяет проводить количественный 3D-анализ сегментарной деформации у эмбрионов zebrafish, обеспечивая раннюю прогностическую ценность для путей повреждения миокарда. Это способствует валидации мишеней и идентификации перспективных соединений-лидеров, выявляя пространственно разрешенные функциональные изменения еще до того, как глобальные показатели, такие как фракция выброса, укажут на нарушение функции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования паттернов сегментарной механической деформации in vivo.
- Практическая ценность: выявляет базальные сегменты желудочков как ранние биомаркеры повреждения, вызванного доксорубицином, что уточняет восприимчивость специфических сигнальных путей.
- Научная ценность: способствует снижению рисков при изучении механизмов, связывая модуляцию пути Notch с сегментарным функциональным восстановлением.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет рассчитывать количественные векторы смещения для каждого сегмента желудочка, что обеспечивает возможность высокосодержательного фенотипического скрининга кардиотоксических соединений.
- Практическая ценность: обеспечивает получение трехмерных данных с микрометровым разрешением, которые воспроизводимы для различных биологических повторностей и условий обработки.
- Научная ценность: выявляет паттерны повреждения, которые не фиксируются при традиционном определении фракции выброса, что повышает чувствительность анализа к ранним сигналам токсичности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует полезность системы для изучения заболеваний путем моделирования кардиотоксичности, вызванной доксорубицином, и последующего восстановления в эмбрионах zebrafish.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять лонгитюдное отслеживание сегментарной регенерации и функционального восстановления после повреждения.
- Научная ценность: Облегчает валидацию доклинических моделей путем корреляции молекулярных воздействий (например, NICD, NRG1) с функциональным восстановлением на уровне тканей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
DIAMOND вписывается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, обеспечивая пространственно-разрешенные функциональные показатели, которые позволяют проводить отбор соединений на основе механизмов их действия.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез путем количественной оценки того, как генетические или фармакологические воздействия изменяют сегментарную механику сердца.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные результаты, готовые к анализу (величины смещения каждого сегмента), для оценки библиотек соединений in vivo.
- Аналитика: Генерирует многомерные данные о смещении (компоненты x, y, z и общая величина), что позволяет проводить статистическое сравнение сердечной функции при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает модуляцию молекулярных путей (Notch) с функциональным восстановлением на модели позвоночных, способствуя согласованию трансляционных биомаркеров.
- Корпоративное использование: Представляет собой адаптируемую платформу с открытым исходным кодом для скрининга кардиотоксичности, которая может быть стандартизирована для исследовательских групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет выявления пространственно неоднородных ответов миокарда.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость благодаря полуавтоматизированной обработке изображений и стандартизированной сегментации желудочков на восемь сегментов.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски на поздних этапах за счет более раннего выявления кардиотоксических свойств в процессе поиска новых соединений.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию соединений с учетом рисков на основе сегментарных функциональных нарушений, а не отсроченных глобальных конечных точек.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с плоскостным флуоресцентным микроскопом и программным обеспечением для 3D-анализа изображений.
- Точность количественной оценки смещения зависит от рабочих процессов изотропного ресэмплинга и совмещения изображений.
- Необходима четкая анатомическая визуализация для определения осей и корректной сегментации желудочка.
- Включает этапы ручной сегментации, которые могут потребовать обучения для обеспечения согласованности при определении границ желудочков.
- Ограничено текущей адаптацией для Danio rerio; применение на млекопитающих требует учета ориентации волокон и ротационного движения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Reconstruction of the 3D Systolic and Diastolic Heart and Segmentation of the Ventricle
2:41
Creation of Rectangular Parallelepipeds for Image Registration and Resampling of Systolic and Diastolic 3D Hearts Along the Short Axis Plane
5:01
Division of the Resampled Heart
6:20
Registration of Systolic and Diastolic Image Matrices and Output of Displacement Vectors
7:01
Results: Segmental Heterogeneity in Cardiac Function and Susceptibility to Chemotherapy-induced Injury
8:45
Conclusion
