Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

Этот метод гибридизации микроаррей полезен для сравнения большого количества образцов из организма с известным геномом. По сравнению с подходом к секвенированию с высокой пропускной способностью объем данных, генерируемых этим методом, гораздо проще в обработке и далее, его можно анализировать более рентабельным способом. Демонстрация процедуры будет д-р Кристиан Зайлер пост-докторской ученый, работающий в исследовательской группе в Rosis в IPK в Gatersleben.

Перед выполнением микроаррей гибридизации с использованием набора гибридизации экспрессии генов, подготовить 10X блокирующий агент в соответствии со спецификациями производителя и aliquot в результате блокирующего агента в 200 микролитер томов. Затем храните блокирующий агент при температуре минус 20 градусов по Цельсию до его использования. В день гибридизации микроаррей, оттепель один 200 микролитер aliquot 10X блокирующий агент на льду и довоенную печь гибридизации до 65 градусов по Цельсию и тепловой блок до 60 градусов по Цельсию.

Подготовьте смесь фрагментации для каждого образца, описанную производителем, и аккуратно смешайте образцы на вихре. После вихря, кратко спина вниз образцов в микроцентрифуге перед инкубацией в течение ровно 30 минут в 60 градусов по Цельсию теплового блока. В конце инкубации, немедленно охладить каждую трубку на льду в течение одной минуты, прежде чем остановить фрагментацию с 25 микролитров 2X буфера гибридизации экспрессии генов, высокие обороты в минуту на трубку.

Смешайте с нежным пипетки, принимая большую осторожность, чтобы не ввести пузырьки, и центрифуга труб в окружающей комнатной температуре. В конце спина немедленно поместите все трубки на лед и загрузите каждый образец в микроаррей слайд как можно быстрее. Далее, медленно обойтись 44 микролитров каждой гибридизации смеси в центре каждой скважины прокладки, заботясь, чтобы избежать введения пузырьков, и добавить 44 микролитров буфера гибридизации в любой неиспользованных скважин.

Сразу же поместите микроаррей слайд в правильной ориентации на верхней части прокладки слайда, заботясь, чтобы не пролить жидкость, и плотно закрыть сборку гибридизации. Поверните сборку, чтобы подтвердить отсутствие стационарных пузырьков воздуха и поместите сборку камеры гибридизации в ротатор печи гибридизации. Установите скорость вращения до 10 оборотов в минуту, а затем начните гибридизацию при 65 градусах по Цельсию ровно на 17 часов.

В то время как образцы гибридизируются, подготовьте три сборки мытья посуды в соответствующих буферах мытья, как указано в таблицах. После ровно 17 часов гибридизации, разобрать одну камеру гибридизации на лабораторной скамейке выстроились с ворсинкой свободной бумаги и передачи одного микроаррей бутерброд с блюдом, содержащим мыть буфер один с микроаррей штрих-код, стоящий в наклонном положении, не погружая весь слайд в буфер. Используя тиски, отделить два стеклянных слайдов и пусть прокладка слайд падение мягко в нижней части блюда, сохраняя при этом твердое сцепление с микроаррей слайд.

Медленно поднимите микроаррей слайд боком для немедленной передачи в стойку microarray в блюдо два с минимальным воздействием воздуха. Когда все восемь слайдов были равномерно размещены вдоль стойки, прикрепите держатель стойки и перенесите всю установку блюда на магнитный мешалка. Перемешать установку осторожно ровно на одну минуту.

В то время как образцы перемешивают, передача блюдо три из 37 градусов по Цельсию инкубатор на второй магнитный мешалка. Затем аккуратно добавить 37 градусов по Цельсию мыть буфер два блюдо три без формирования пузырьков. В конце перемешивания инкубации, осторожно и медленно передать слайд стойку блюдо три и удалить держатель стойки.

После перемешивания в течение ровно одной минуты, медленно и осторожно удалить слайд стойку из блюда и использовать ворсинку свободной бумаги, чтобы тщательно высушить обе стороны каждого слайда, размещение каждого слайда в слайд-бокс, как он высушивается. После того, как слайды высохнут в течение 15 минут, перенесите каждый микроаррей слайд в держатель слайда со штрих-кодом вверх и загрузите собранные держатели слайдов в сканирующей карусели и последовательности в соответствии с номером штрих-кода. Затем немедленно сканируйте слайды.

На этом рисунке показан репрезентативный результат запуска для проверки качества извлечения РНК. В типичных анализах образцов низкого содержания крахмала, таких как листья ячменя, видны дополнительные рибосомные РНК-полосы из хлоропластов. Образцы с высоким содержанием крахмала, такие как семена ячменя, демонстрируют 18 и 28S рибосомную РНК.

Обратите внимание, что не автоматизированное значение числа целостности РНК может быть рассчитано для зеленых тканей растений, таких как образцы листьев, из-за хлоропласт рибосомной РНК. В этом репрезентативном анализе, подготовка РНК и гибридизация на заказ чипа микроаррей ячменя были выполнены, как попродемонстрировано. Сетка показывает пример полученных сигналов из каждого угла чипа, включая фон и всплеск точек считывания, используемых для калибровки.

Гистограмма указывает на отклонение обнаруживаемых точек с соответствующей интенсивности сигнала. Как отмечается, успешная гибридизация дает широкую гауссийской кривой с незначительными выбросами. Здесь показан отчет о контроле качества обнаруженных сигналов.

Значения для гибридизированного слайда даются во второй колонке, а диапазон допустимых значений отображается в столбце 4. Этот метод может быть использован для решения любых экспериментальных создан для любого организма, где существенная информация о геноме доступна. Использование этого метода в нашей лаборатории позволило нам сравнить и проанализировать транскрипционные изменения в рисе и ячмене, которые происходят после индукции стресса роста.