Многомерная система кокультуры для моделирования плоского квадроцикла Прогрессирование карциномы
17 марта 2020 г.
Система модели in vitro была разработана для захвата архитектурных изменений тканей при плоской карциноматической карциномате легких (LUSC) прогрессии в трехмерной (3D) совместной культуре с связанными с раком фибробластами (CAFs). Эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для изучения роли различных опухолевых клеток, интродуцированных и насущных изменений, которые модулируют фенотип опухоли.
Наша культурная система фиксирует фенотипической пластичности клеток плоскоклеточной карциномы легких в ответ на опухолевых взаимодействий стромы и как эти взаимодействия регулируют морфологию опухоли во время прогрессирования плоскоклеточной карциномы легких. Основным преимуществом нашей системы является ее способность моделировать биологию плоскоклеточных клеток легких в 3D-контексте, сохраняя при этом пластичность злокачественных клеток. Эта 3D кокультура обеспечивает уникальную систему для исследования опухолевых взаимодействий клеток стромы и может быть адаптирована для мониторинга реакций клеток карциномы плоскоклеточных легких и связанных с раком фибробластов для лечения наркомании.
Для начала оттаивать флаконы мембранной матрицы подвала в четырехградсовом холодильнике по Цельсию на ночь. Охладить двухми миллилитров пластиковые пипетки и советы при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь. На следующий день, тепло реагентов, используемых для разобщения TUM622 клеток, HEPES буфер, трипсин / ЭДТА, и трипсин нейтрализации буфера в 37-градусной по Цельсию водяной бане.
Вывихнул из холодильника оттаявую мембранную матрицу подвала и положите флакон на лед. Охладить пластины культуры тканей на металлической платформе кулер размещены на льду. Поместите центрифуговые трубки на металлическую стойку охлаждения на льду.
Рассчитайте количество необходимых клеток на основе количества скважин и концентрации клеток в каждой скважине, чтобы быть готовым. Передача TUM622 клеточной подвески в охлаждено центрифугу трубки и спина вниз на 300 раз г в висит ведро центрифуги при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. С аспирирующим пипеткой, прикрепленной к нефильтрованной наконечнику, аспирировать супернатант тщательно, оставляя около 200 микролитров среды в трубке.
Аккуратно нажмите на стороне трубки, чтобы выбить и разобщить гранулы, а затем вернуть его в стойку охлаждения. Используя двухми миллилитровые предварительно обмазаемые пипетки, аккуратно смешайте матрицу на льду, трубя вверх и вниз несколько раз. Pipette на равномерной и умеренной скорости, так что никаких пузырьков вводятся в матрицу во время этой процедуры.
Перенесите 1,1 миллилитров матрицы в каждую центрифугу. Используя предварительно облеарелые кончики, пипетка матрицы в каждой трубке вверх и вниз около 10 раз, чтобы сделать равномерной подвески клеток. Перенесите 310 микролитров клеточной матричной подвески в каждую колодец предварительно заправленной 24-хорошой пластины.
Поместите пипетки под углом 90 градусов к поверхности пластины и добавьте подвеску к центру колодец. Подвеска распространяется и охватывает всю колодец. Для облегчения анализа иммунофлуоресценции ниже по течению перенесите 60 микролитров клеточной матричной подвески в хорошо центр двухколодецовой камерной горки.
Это позволяет матрице образовывать куполообразную конструкцию с гораздо меньшим объемом. Верните пластину и камеру слайд обратно в инкубатор культуры тканей и инкубировать в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеть. После этого изучите пластину и сдвиньте под световым микроскопом, чтобы гарантировать равномерное равномерное равномерное распределение одиночных ячеек в матрице.
Добавьте один миллилитр предварительно разогретой 3D-культуры в каждый колодец пластины и 1,5 миллилитров 3D-культуры в каждый колодец камерного слайда, а затем верните их в инкубатор. После подготовки клеточных суспензий TUM622 и CAFs, как описано ранее, подсчитайте плотность клеток CAF, смешивая 10 микролитров клеточной подвески с 10 микролитров трипан-синего цвета. Добавьте 10 микролитров смеси к каждой из двух камер на гемоцитометре, чтобы подсчитать и рассчитать плотность клеток.
Для совместного встраивания клеток TUM622 и CAFs в мембранную матрицу подвала сначала вычислите нужное количество клеток, используемых для покрытия на основе информации о плотности клеток. CAFs посеяны в соотношении 2:1 клеток TUM622. Перенесите расчетный объем TUM622s, а также подвеску ячейки CAF в ту же трубку центрифуги.
Спин вниз и аспирировать все среды. Resuspend в матрице мембраны подвала и плите 310 микролитров смеси в каждый колодец плиты 24-хорошо. Для иммунофторесценции перенесите 60 микролитров смесей TUM622 и CAF на камерные слайды, как описано ранее.
Для совместной культуры TUM622 с наложенными CAFs в мембранной матрице подвала, сначала создали монокультуру TUM622, как описано ранее, передача в два раза больше подвески CAF в центрифугу трубки, и спина вниз в 300 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно избавлять CAFs в среде культуры, передавать в два раза больше клеток CAF, которые были повторно использованы в среде культуры в каждой из скважин, содержащих встроенные клетки TUM622. Типичные клетки TUM622 в 2D культуре округляются большими ядрами, в то время как CAFs плоские и удлиненные.
Посеянные в 3D-культуре, одиночные клетки TUM622 были способны формировать органоиды с ацинароподобными морфологиями при встроении. Между днями 5 и 7, lumen стало явно в acinarlike структурах и остало полым в дальнейшем. Каждый ацинус, состоящий из монослой клеток, окружающих полый люмен, отображается надлежащей апиальной базальной полярности похож на эпителия легких in vivo.
Эти ацинарные структуры были гиперпластичными и продолжали расти до 24 дней, прежде чем внеклеточная матрица полностью распалась. В кокультурах TUM622-CAF, либо наложения или совместного встраивания, наличие CAFs значительно увеличило количество и размер сфероидов формируется. Интересно, что, когда TUM622 acini вошел в непосредственной близости с CAFs, они побудили acini стать инвазивными и мигрировать в сторону CAFs, образуя слезы, как структуры.
Для обеспечения надежного образования ацинароподобных структур крайне важно поддерживать матрицу мембраны подвала в жидком виде в течение всего процесса встраивания клеток. Органоиды TUM622 могут быть использованы для различных анализов вниз по течению, включая, но не ограничиваясь иммунофлуоресцентной, иммуногистохимией, цитометрией потока, РНК и извлечением белка, а также могут быть модифицированы для скрининга лекарств. Используя эту систему в качестве платформы, можно исследовать, как опухолевые клетки внутренние, а также клеточные внешние изменения в микрооквидеоронации опухоли может повлиять на эпителиальной архитектуры опухоли и образования карциномы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена модель in vitro для изучения изменений архитектуры тканей при прогрессировании плоскоклеточного рака легкого (LUSC). 3D-сокультивирование с рак-ассоциированными фибробластами (CAFs) позволяет исследовать внутренние и внешние изменения в опухолевых клетках, которые влияют на фенотип опухоли.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Плоскоклеточный рак легкого (LUSC) обладает фенотипической пластичностью.
- Взаимодействия между опухолью и стромой играют критическую роль в регуляции морфологии опухоли.
- Системы 3D-культивирования необходимы для моделирования сложной биологии опухоли.
- Понимание этих взаимодействий может помочь в разработке таргетной терапии.
Цель исследования
- Для моделирования биологии плоскоклеточного рака легкого в 3D-контексте.
- Для исследования взаимодействий между опухолевыми клетками и рак-ассоциированными фибробластами.
- Для оценки адаптивности системы при изучении ответов на лекарственную терапию.
Используемые методы
- Разработка системы 3D-сокультивирования.
- Размораживание и подготовка матрикса базальной мембраны.
- Диссоциация клеток TUM622 с использованием специфических буферов.
- Мониторинг взаимодействий между опухолью и стромой in vitro.
Основные результаты
- Система эффективно отражает пластичность клеток LUSC.
- Взаимодействия с CAFs оказывают значительное влияние на морфологию опухоли.
- Возможна адаптация системы для мониторинга эффективности лекарственной терапии.
- Модель позволяет получить представление о биологии опухоли и ее ответе на лечение.
Выводы
- Система 3D-сокультивирования является ценным инструментом для изучения LUSC.
- Понимание взаимодействий между опухолью и стромой может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Данная модель может способствовать разработке методов таргетной терапии рака.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Моделирование взаимодействий между опухолью и стромой в физиологически релевантном 3D-контексте устраняет критический пробел в разработке лекарственных средств для лечения плоскоклеточного рака легкого, при котором традиционные 2D-системы не позволяют зафиксировать нарушение эпителиальной архитектуры и инвазивные фенотипы. Данная органоидная платформа обеспечивает механистическое снижение рисков при выборе мишеней за счет сохранения фенотипической пластичности раковых клеток и воспроизведения динамического влияния микроокружения, что повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и проведении кампаний по фенотипическому скринингу. Адаптивность системы для последующего анализа делает ее многократно используемым инструментом на этапах от раннего поиска до доклинических исследований, что снижает уровень биологических потерь в онкологических портфелях разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем моделирования того, как взаимодействия между опухолью и стромой регулируют архитектуру эпителия в процессе прогрессирования карциномы.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством наблюдения за инвазивной морфологией, индуцированной CAF, и формированием ациноподобных структур в системе, соответствующей патологическому процессу.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов за счет фиксации фенотипической пластичности клеток плоскоклеточной карциномы легкого в ответ на сигналы микроокружения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет подготовить валидированные биологические системы для скрининга соединений путем поддержания ацинарно-подобной морфологии с правильной апикально-базальной полярностью в течение длительных периодов культивирования.
- Операционная ценность: Стандартизирует результаты анализа с помощью количественных структурных показателей, таких как размер и количество сфероидов, а также появление инвазивных образований в форме слезы в ответ на стромальные сигналы.
- Ценность масштабируемости: Облегчает повторное использование платформы для мониторинга воздействия лекарственных препаратов, так как кокультуру можно адаптировать для оценки ответа как опухолевых клеток, так и рак-ассоциированных фибробластов на терапевтическое воздействие.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Моделирует динамику систем, значимых для заболевания, за счет воспроизведения ключевых особенностей архитектуры тканей плоскоклеточного рака легкого и стромальных взаимодействий, наблюдаемых при туморогенезе.
- Доклиническая преемственность: Обеспечивает связь между поиском новых мишеней и доклинической валидацией, позволяя анализировать внутренние и внешние механизмы опухолевых клеток, которые способствуют нарушению эпителиальной структуры, что помогает принимать обоснованные решения о переходе к следующим этапам с учетом рисков.
- Соответствие биомаркерам: Поддерживает поиск трансляционных биомаркеров благодаря совместимости с последующими протоколами иммунофлуоресцентного и иммуногистохимического анализа, а также методами экстракции РНК и белков.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в общий процесс исследований — от проверки гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений-лидеров и доклинической валидации, что обеспечивается его способностью моделировать динамические взаимодействия между опухолью и стромой, а также получать количественные фенотипические показатели.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, демонстрируя, как совместное встраивание или наложение CAF способствует формированию сфероидов и вызывает инвазивную морфологию в виде «слезы» в ацинусах TUM622.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого формирования 3D-кокультуры, что позволяет стандартизировать оценку влияния соединений на системы кокультуры опухоль-строма.
- Аналитика: позволяет проводить количественные измерения формирования ациноподобных структур, развития просвета, размера сфероидов и паттернов инвазивной миграции для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связаны с доклинической работой посредством моделирования нарушения эпителиальной архитектуры и стромально-опосредованной инвазии — ключевых процессов прогрессирования карциномы, имеющих значение для терапевтического вмешательства.
- Повторное использование в организации: функционирует как адаптируемая платформа, а не как одноразовая методика, совместимая с иммунофлуоресцентным анализом, проточной цитометрией и скринингом препаратов в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность путем моделирования фенотипической пластичности опухолевых клеток и стромально-зависимых морфологических изменений в 3D-системе плоскоклеточного рака легкого.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость за счет определенных соотношений клеток (2:1 CAF:TUM622), протоколов работы с матриксом и количественно оцениваемых структурных фенотипов.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), снижая риски по мишеням за счет наблюдения за инвазией и разрушением эпителия под воздействием микроокружения, что уменьшает вероятность биологической неудачи на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с поправкой на риск путем выявления мишеней, модуляция которых влияет на взаимодействия между опухолью и стромой, а также на переход от ацинарного к инвазивному росту в физиологически релевантной модели.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток, манипуляций с трехмерным внеклеточным матриксом и соблюдение правил стерильности при создании системы совместного культивирования.
- Необходим доступ к матриксу базальной мембраны, оборудованию с контролем температуры (4°C, 37°C) и инвертированному светлому микроскопу для оценки морфологии.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов подготовки клеток, смешивания матрикса и посева для обеспечения стабильного формирования ацинарных структур у разных пользователей.
- При расширении метода на другие типы фибробластов или опухолевые модели, помимо TUM622 и CAF, ассоциированных с плоскоклеточным раком легкого, необходимо учитывать особенности адаптации.
- Практические ограничения включают необходимость поддержания матрикса в жидком состоянии во время инкапсуляции и ограниченный срок культивирования до распада матрикса (~24 дня), что подтверждается исходными данными.
