Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts
25 июля 2020 г.
Здесь мы представляем протокол для проверки эффективности целевых методов лечения, отобранных на основе геномного состава опухоли. Протокол описывает идентификацию и проверку структурных перестановок ДНК, привитие опухолей пациентов в мышей и тестирование ответов на соответствующие препараты.
Описанный здесь протокол направлен на демонстрацию алгоритма тестирования эффективности лечения с использованием моделей рака in vivo. Протокол состоит из комбинации нескольких методов. Для выявления геномных изменений используется биосеквенирование всего генома образцов опухолей человека.
К ним относятся как перестановки генов, так и изменения числа копий генов. Таким образом, анализ выявленных изменений проводится для того, чтобы выбрать потенциально наркотические изменения. Препараты, отобранные на основе геномного анализа, затем используются для лечения соответствующих опухолей, выращенных у мышей с ослабленным иммунитетом.
Разработанный алгоритм представляет собой перспективный подход к оказанию помощи в принятии решений по лечению онкологических больных. Используйте инструмент Panda или аналогичное программное обеспечение для определения целевых изменений. Мы можем перечислить гены, которые были идентифицированы по микросеккенкированию, в результате чего был простой файл, очерченный вкладкой, используя стандартные принятые символы генов.
Добавьте знак фунта к заголовку списка, чтобы убедиться, что заголовок таблицы передается на уровень пути U программного обеспечения. Загрузите файл, нажав на соответствующую навигационную вкладку. Назначьте один значок для представления базовых данных, нажав на значок выбора, а затем нажав на завершенную вкладку.
После загрузки файлов пациента просмотрите страницу, чтобы определить столбец, отображаемый количество аннотированных генов на пути. Это последняя колонка справа. Используйте фильтр пути в левом верхнем левом верхнем левом части главного окна, чтобы ограничить количество путей, отображаемых на те, которые содержат гены интереса.
Чтобы определить пути, которые имеют больше генов аннотированы, чем можно было бы ожидать случайно, используйте функцию, расположенную под вкладкой обогащения. Затем столбец добавляется в основную таблицу, которая показывает соответствующую p-значение из точного теста Фишера. Выберите базу данных для отображения потенциальных генов с наркотиками из предустановленной аннотации, проверив соответствующий значок слева от основного окна.
Чтобы выбрать путь для визуализации, нажмите на его имя, отображаемое на странице просмотра пути. Рядом с ассоциированным геном отображаются значки, представляющие каждый набор аннотации. Нажатие на любой ген в пути откроет соответствующую страницу генных карт.
Выберите пути, которые показали аннотированные гены, представляющие интерес и хиты для потенциальных препаратов для дальнейшего анализа. Выполните работу ткани в капюшоне ламинарного потока для поддержания стерильных условий. Положите опухолевые ткани в блюдо, содержащее холодный PBS или ткани культуры средств массовой информации, таких как RPMI, DMEM, содержащие антибиотики.
Определить и изолировать жизнеспособный опухолевый материал из смежных нормальных и некротических тканей с помощью патологоанатома. Используйте стерильные типсы и скальпель для удаления некротического материала, отмеченного патологоанатомом. Для выполнения подкожного прираздела, разрежьте опухолевую ткань стерильными мипсами, скальпелем или хирургическими ножницами на мелкие фрагменты, размером примерно 2 х 2 х 2 миллиметра.
Перенесите фрагментированную ткань в предварительно охлажденную чашку Петри на льду. Пусть холодный матригель в блюдо с фрагментированной ткани, около 200 микролитров на 10 кусков ткани. Хорошо перемешать и дайте фрагментам ткани замочить в матригеле в течение 10 минут.
Используйте стерильные хирургические ножницы и типсы, чтобы сделать 5-10 миллиметров вертикального разреза кожи на обоих флангах мыши. Вставьте прямые миппы осторожно в подкожное пространство, чтобы создать карман достаточно большой для фрагмента опухоли, чтобы быть помещены под жировой подушечку. Используйте стерильные прямые типсы, чтобы вставить фрагменты опухоли в ранее подготовленный карман в каждой из пяти мышей.
Закройте разрез кожи с помощью тканевого клея. После имплантации, чтобы ингибировать пролифкоцитов пролиферации, вводить каждой мыши с 100 микролитров ритуксимаба. Подготовь мышь к пероральному гаважу, ущипнув кожу спины и согнув ее назад, чтобы голова и губы мыши были обездвижены.
Вставьте зонд gavage вниз задней части горла мыши, пока зонд не достигнет пищевода. Убедитесь, что зонд не вставляется слишком далеко, как легкие мыши может перфорировать вызывая смерть. Репрезентативный поплавок генома иллюстрирует ландшафт геномных изменений в одной опухоли.
Типичные для высококачественных опухолей серосубтипа, несколько завоеваний синих линий и потерь красных линий, были определены с указанием высоких уровней геномной нестабильности. Верхней тенденцией изменения терапевтического вмешательства в опухоли OC101 было усиление в хромосоме 17, с участием ERBB2, ген, который кодирует рецептор HER2. Для проверки результатов на уровне ДНК, несколько наборов конкретных грунтовки были разработаны для краев усиленной области.
И ПЦР был проведен. Ни один продукт усиления не был поглощен при контроле человеческой ДНК. Конкретные полосы были определены для OC101 ДНК опухоли.
В другом варианте опухоли, T14, многочисленные успехи ДНК наблюдались. К ним относятся AKT2 в генах RICTOR. Проверка, проведенная на уровне белка, с использованием иммуноблоттинга показала высокий уровень АКТ в РИКТОРЕ.
Значительное снижение бремени опухоли наблюдалось в группе химиотерапии к концу шестой недели. Существовал дополнительное преимущество по поводу химиотерапии только в группах, которые получили комбинированное лечение. Опухолевая ткань была собрана для молекулярного анализа реакции лечения в конце испытания лечения.
Общие и фосфорилированные уровни S6, AKT и mTOR были определены с использованием иммуноблоттинга. Сравнение уровней этих белков в необработанных, обработанных химиотерапией и обработанных ингибитором АКТ или mTOR показало заметное снижение для последних двух. Представленный подход очень полезен для проведения клинических испытаний в моделях PDX.
Он использует молекулярные характеристики опухоли, полученные путем геномного профилирования, чтобы определить наилучший выбор препаратов для тестирования.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен алгоритм тестирования эффективности таргетной терапии на основе геномного профиля опухолей. Он включает идентификацию структурных перестроек ДНК и имплантацию опухолей пациентов мышам для тестирования ответа на лекарственные препараты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Геномика
- Фармакология
Теоретические основы
- Таргетная терапия подбирается на основе геномных перестроек.
- Понимание перестроек ДНК позволяет определить возможные варианты лечения.
- Модели in vivo необходимы для тестирования эффективности препаратов.
- Для трансплантации опухолей используются иммунодефицитные мыши.
Цель исследования
- Для подтверждения эффективности препаратов, отобранных с помощью геномного анализа.
- Для разработки протокола тестирования таргетной терапии in vivo.
- Для более глубокого понимания реакций опухоли на специфическое лечение.
Используемые методы
- Полногеномное биосеквенирование образцов опухолей человека.
- Идентификация геномных перестроек, включая перестройки генов.
- Отбор потенциально доступных для терапевтического воздействия изменений на основе проведенного анализа.
- Лечение опухолей in vivo у иммунодефицитных мышей.
Основные результаты
- Успешная идентификация структурных перестроек ДНК.
- Валидация выбранных препаратов на мышиных моделях.
- Демонстрация эффективности лечения на основе геномного анализа.
- Понимание поведения опухоли в ответ на таргетную терапию.
Выводы
- Данный протокол создает основу для тестирования методов таргетной терапии.
- Геномный анализ имеет решающее значение для выбора эффективных методов лечения.
- Модели in vivo представляют большую ценность для понимания реакций на лекарственные препараты.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики оценивать таргетную терапию с использованием моделей ксенографтов, полученных из тканей пациентов, на основе геномного профилирования, что способствует выбору препаратов на базе выдвинутых гипотез и снижению механистических рисков на этапе доклинических исследований. Связывая структурные изменения ДНК с функциональным ответом на лекарственные препараты, этот подход повышает прогностическую уверенность в валидации мишени и помогает принимать решения о целесообразности применения комбинированной терапии. Данный метод особенно актуален для опухолей с высокой геномной нестабильностью, при которых стандартная терапия оказывается неэффективной и рассматривается возможность применения препаратов вне инструкции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая структурные изменения ДНК, такие как амплификации и перестройки генов, с доступными для воздействия лекарственных мишенями, такими как ERBB2/HER2 и AKT2.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней in vivo с использованием PDX-моделей, что снижает неопределенность механизмов действия перед этапом оптимизации соединений-лидеров.
- Прогностическая ценность: демонстрирует корреляцию между геномными прогнозами и наблюдаемыми ответами опухоли, помогая в приоритизации портфеля препаратов на основе степени уверенности в мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем (моделей PDX) с охарактеризованными геномными профилями для надежной оценки соединений при последующем скрининге.
- Практическая ценность: Стандартизация протоколов трансплантации опухолей и лечения, что повышает воспроизводимость исследований и позволяет проводить масштабируемое доклиническое тестирование.
- Готовность анализа: Получение количественных молекулярных показателей (например, фосфорилированных S6, AKT, mTOR) с помощью иммуноблоттинга для оценки ингибирования сигнальных путей и ответа на лечение.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: использование опухолей, полученных от пациентов, для сохранения релевантности заболевания, что позволяет связать геномные данные, полученные из образцов человека, с моделями in vivo.
- Доклиническая валидация: поддержка принятия решений о продвижении исследований с учетом рисков путем демонстрации снижения опухолевой нагрузки и специфических эффектов препаратов на определенные сигнальные пути in vivo.
- Механистическое снижение рисков: уточнение того, обусловлена ли наблюдаемая эффективность монотерапией или комбинированным лечением, что служит основой для планирования дизайна клинических исследований.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрирует геномный анализ с тестированием эффективности in vivo, занимая промежуточное положение между идентификацией мишени и оптимизацией ведущего соединения в континууме поиска новых лекарственных средств, что позволяет обеспечить переход к доклинической разработке на основе полученных данных.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала путем подтверждения того, являются ли структурно измененные гены функционально доступными для воздействия лекарственных препаратов in vivo.
- Скрининг: позволяет создавать готовые к анализу PDX-модели с известными геномными драйверами, что обеспечивает надежный скрининг соединений и оценку комбинированной терапии.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (опухолевая нагрузка, фосфорилирование белков), что позволяет исследовательским группам сравнивать эффекты препаратов и оценивать взаимодействие с мишенью.
- Трансляционные исследования: обеспечивает непрерывность перехода от опухоли пациента к доклинической модели, поддерживая согласование биомаркеров и прогностическое моделирование клинического ответа.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимый рабочий процесс для тестирования таргетной терапии при различных типах опухолей, сокращая избыточную разработку моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней, подтверждая, что изменения на уровне ДНК приводят к функциональной чувствительности к препарату in vivo.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов обработки тканей, имплантации и введения препаратов.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет приоритизации мишеней с доказанной эффективностью in vivo, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов в препараты с учетом рисков, основываясь на соответствии между геномным прогнозом и ответом PDX-модели.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области геномики рака, патоморфологии и моделирования in vivo для точной изоляции жизнеспособной опухолевой ткани и интерпретации геномных изменений.
- Зависимость от инфраструктуры секвенирования следующего поколения и биоинформатических инструментов (например, Panda tool) для анализа структурных перестроек и обогащения сигнальных путей.
- Необходимость в стандартизированных процедурах стерильной фрагментации опухоли, смешивания с Matrigel и подкожного трансплантирования для обеспечения успешного приживления.
- Требуется возможность проведения иммуноблоттинга для оценки модуляции нижележащих путей (например, AKT/mTOR/S6) в качестве фармакодинамических показателей.
- Ограничено временными и ресурсными затратами на создание PDX-моделей, что может ограничить пропускную способность при проведении крупномасштабных скрининговых кампаний.
