Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток
23 февраля 2021 г.
Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.
Анализ боковых популяций клеток является одним из широко используемых методов выделения и идентификации раковых стволовых клеток из опухолевых тканей и линий опухолевых клеток. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Этот метод может способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволовых клеток опухолевых клеток.
Многие факторы могут влиять на процент SP-клеток в этом анализе, поэтому очень важно изучить надлежащие условия до формального эксперимента. Засевают опухолевые клетки в шестиямяцную пластину и инкубируют их в инкубаторе с 37 градусами Цельсия, снабженном 5% углекислым газом. Когда плотность клеток достигнет около 90%, аспирируют культурную среду и дважды промывают клетки тремя миллилитрами PBS.
Затем добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую лунку и инкубируем пластину при 37 градусах Цельсия в течение одной-трех минут. Осторожно постучите по пластине, чтобы отсоединить клетки, добавьте три миллилитра PBS, дополненных 2% FBS, в каждую лунку, и пипеткой клетки вверх и вниз три-пять раз, чтобы рассеять сгустки клеток. Исследуйте клеточную суспензию под микроскопом.
Если клеточные сгустки присутствуют, пропустите суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр. Переложите ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугируют их в 200 раз в г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендировать клетки в трех миллилитрах PBS, дополненных 2% FBS, пипетируя клетки вверх и вниз три-пять раз для смешивания.
Подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра и разбавьте их в PBS, дополненном 2% FPS, до конечной концентрации в один раз 10 до шести клеток на миллилитр. Подготовьте две пятимиллилитровую, полистирольные, круглодонные пробирки и добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую пробирку. Пометьте одну трубку как пробирку, а другую как блокируруюруюрую управляя трубку.
Готовят раствор блокатора, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в блокатор контрольной трубки и хорошо перемешайте, затем инкубируйте трубку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Встряхивая тюбик каждые 10 минут.
Готовят раствор Hoechst 33342, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в пробирку и блокатор контрольной трубки отдельно и хорошо перемешайте, затем инкубируйте пробирки при 37 градусах Цельсия в течение 60 минут. Встряхивая тубы каждые 10 минут.
После инкубации центрифугируют клетки в течение пяти минут при 200 раз г и четырех градусах Цельсия, затем осторожно аспирируют супернатант. Повторно суспендировать клетки в каждой трубке одним миллилитром ледяного PBS, дополненного 2% FBS, затем пипеткой клетки вверх и вниз для смешивания. Добавьте один микролитр одного миллиграмма на миллилитр йодида пропидия, или PI, в каждую трубку и перемешайте.
Перейдите на вкладку Параметры в программном обеспечении проточного цитометра. Сначала выберите параметры FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Во-вторых, выберите логарифмическую шкалу для параметра PI.
Наконец, выберите шкалы площади и ширины для параметров FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Сначала запустите ячейки из пробирки, затем запустите ячейки из блокаторной контрольной трубки, используя те же напряжения и затворы. Соберите от 20 до 100 000 событий из каждого образца, чтобы проанализировать процент SP-клеток.
Этот метод был использован для определения доли SP-клеток в клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231. Точечный график FSC-A против PI-A показал популяцию мертвых клеток, клеточного мусора и основную популяцию PI-отрицательных клеток, которая была подвергнута дальнейшему анализу. Для анализа доли клеток, обработанных резерпином, была использована популяция одной клетки, выделенной из точечного графика FSC-A против FSC-W и точечного графика SSC-A против SSC-W, которая составляла около 0,9% в необработанных клетках и около 0,09% в клетках, обработанных резерпином.
Различные концентрации окрашивания Hoechst 33342 были протестированы на клетках MDA-MB-435, и было определено, что два микрограмма на миллилитр были оптимальными для анализа SP. Низкие концентрации затрудняли различие SP-клеток от других популяций, в то время как высокие концентрации вызывали исчезновение SP-клеток. Верапамил и резерпин были протестированы для определения правильного блокатора для клеток MDA-MB-435.
Около 0,4% клеток изгоняли краситель после лечения верапамилом, но соотношение снизилось примерно до 0,1% после лечения резерпином, демонстрируя, что резерпин является более подходящим блокатором для этой клеточной линии. Этот протокол также использовался для определения доли SP-клеток в клетках аденокарциномы легкого A549 человека, обработанных активатором STAT3 коливелином, и в клетках рака молочной железы человека T47D, обработанных ингибитором FRA1 SKLB816. Этот анализ дает ключ к регуляторным эффектам сигнальных путей на особенности раковых стволовых клеток и облегчает открытие новых механизмов, которые в конечном итоге могут направлять таргетную терапию опухолей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли клеток боковой популяции в клеточных линиях солидных опухолей. Анализ клеток боковой популяции имеет решающее значение для изоляции и идентификации раковых стволовых клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Клетки боковой популяции имеют важное значение для изучения раковых стволовых клеток.
- Данный метод помогает в понимании свойств стволовости опухолевых клеток.
- На процент содержания SP-клеток влияет множество факторов.
- Надлежащие условия эксперимента имеют решающее значение для получения точных результатов.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод измерения клеток боковой популяции.
- Углубить понимание биологии раковых стволовых клеток.
- Способствовать исследованию влияния различных сигналов на опухолевые клетки.
Используемые методы
- Высейте опухолевые клетки в шестилуночный планшет.
- Инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
- Аспирируйте культуральную среду, когда плотность клеток достигнет примерно 90%.
- Промойте клетки PBS перед анализом.
Основные результаты
- Метод является эффективным и экономически выгодным.
- Он позволяет выделять раковые стволовые клетки из тканей опухоли.
- Для точного измерения количества SP-клеток крайне важно соблюдение надлежащих условий.
- Данный подход способствует пониманию биологии опухолевых клеток.
Выводы
- Представленный метод является ценным инструментом для исследований рака.
- Он помогает в идентификации раковых стволовых клеток.
- Будущие исследования могут опираться на данный метод для изучения биологии опухолей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция раковых стволовых клеток с помощью анализа боковой популяции позволяет снизить механистические риски при изучении путей стволовости опухоли, что способствует валидации мишеней в онкологических исследованиях. Данный метод обеспечивает получение количественных, воспроизводимых данных о популяциях стволоподобных клеток, что помогает при идентификации ведущих соединений и выборе доклинических моделей. Экономическая эффективность и адаптивность метода для различных линий солидных опухолей обеспечивают трансляционную преемственность от ранних этапов поиска до скрининга, ориентированного на конкретные сигнальные пути.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем количественного определения активности эффлюкса стволоподобных клеток, связанной с функцией ABC-транспортеров.
- Практическая ценность: Обеспечение функциональной валидации мишеней с помощью блокады ингибиторами (например, верапамилом, резерпином) для подтверждения специфичности фенотипа SP.
- Трансляционная ценность: Повышение прогностической достоверности путем установления связи между модуляцией генов или путей (например, активатором STAT3, ингибитором FRA1) и изменениями частоты встречаемости SP.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем выделения фракций, обогащенных SP-клетками.
- Практическая ценность: Стандартизация анализа эффлюкса красителя с помощью оптимизированной концентрации Hoechst 33342 (2 µg/mL) и титрования блокаторов для обеспечения воспроизводимости.
- Трансляционная ценность: Создание масштабируемых и многократно используемых рабочих процессов для оценки влияния соединений на свойства раковых стволовых клеток в различных клеточных линиях (MDA-MB-231, MDA-MB-435, A549, T47D).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет измерять свойства стволовости в системе, релевантной для заболевания, с целью моделирования механизмов инициации, метастазирования и рецидивирования опухоли.
- Практическая ценность: Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем корреляции модуляции SP с эффективностью ингибиторов сигнальных путей.
- Трансляционная ценность: Способствует согласованию биомаркеров путем установления связи между колебаниями SP и влиянием внеклеточных/внутриклеточных сигналов на стволовость опухолевых клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на ранних этапах поиска и служит для проверки гипотез и снижения биологических рисков до этапа идентификации ведущих соединений, при этом полученные результаты определяют направление дальнейших доклинических исследований.
- Открытия в биологии: позволяет уточнить механизмы сигнальных путей путем количественной оценки влияния генетических или фармакологических воздействий на стволовость клеток, производных от SP.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной подготовки клеток, окрашивания и гейтирования при проточной цитометрии (FSC-A по сравнению с PI-A, FSC-W, SSC-W).
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (процент SP) для сравнения условий (например, необработанных клеток и клеток, обработанных резерпином).
- Трансляционные исследования: связывают фундаментальные открытия с доклинической валидацией путем оценки модуляции стволовости в моделях аденокарциномы легкого и рака молочной железы.
- Корпоративное использование: функционирует как модульный инструмент для различных типов солидных опухолей, сокращая необходимость в повторной разработке аналогичных анализов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях раковых стволовых клеток за счет прямого функционального анализа эффлюкса красителя.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной концентрации клеток (1×10⁶ cells/mL), условиям инкубации (37°C, 5% CO₂) и использованию блокирующих контролей.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет статистически достоверной идентификации регуляторов путей стволовости (например, STAT3, FRA1).
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе эффективности модуляции SP в различных моделях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с компенсацией и гейтированием в проточной цитометрии для параметров Hoechst Blue/Red и PI.
- Зависит от наличия доступа к проточным цитометрам с возможностью логарифмического масштабирования PI и детектирования площади/ширины сигнала.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов подготовки, промывки и блокировки клеток для минимизации вариабельности.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных типов опухолей, так как оптимальная концентрация Hoechst и эффективность блокировки различаются (например, MDA-MB-435 по сравнению с A549).
- Практическое ограничение: чувствительность анализа SP зависит от правильного исключения мертвых клеток и клеточного дебриса с помощью гейтирования по PI, что продемонстрировано на точечных диаграммах для MDA-MB-231.
