Новый инструментарий для оценки функций генов с использованием условной стабилизации Cas9

Этот метод обеспечивает быстрое редактирование гена CRISPR-Cas9 с контролируемой температурой под небольшой молекулой Shield-1. Он также предлагает меньше нецелевые эффекты, более низкую токсичность клеток, а также более высокое внутренне контролируемое редактирование генов при сравнении его с конститутивной активацией Cas9. Основным преимуществом этой частицы является то, что ее можно использовать для характеристики эссенциального гена, а также генов выживания опухоли.

Дестабилизация DD-Cas9 не зависит от его экспрессии, и это позволяет совместно экспрессировать интересующее ген под одним и тем же промоутером. Этот метод можно легко применить к исследованиям in vivo и in vitro. Щит-1 также может проникать через гематоэнцефалический барьер, что облегчает изучение генов, участвующих в развитии мозга.

Равномерно сеять здоровые клетки HEK293T при плотности от одного до двух миллионов клеток на 10-сантиметровую тканевую культуральную пластину с использованием 10 миллилитров глюкозы DMEM с 10% отфильтрованным FBS. Инкубируют клетки в инкубаторе культуры тканей при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия в течение 20 часов. На следующий день подтвердите, что клетки достигли 70% слияния с помощью микроскопии с ярким полем и что они равномерно распределены по пластине.

Замените носитель за час до трансфекции с конечным объемом 10 миллилитров. Подготовьте две трубки с 500 микролитрами теплой среды. Добавьте 25 микролитров трансфекционного реагента в одну трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

К другой трубке добавить смесь плазмид. Смешайте одну трубку с трубкой две, чтобы сформировать трансфекционную смесь, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавьте трансфекционную смесь по каплям в клетки HEK293T и инкубирует пластину в инкубаторе культуры тканей.

Через 18 часов осторожно измените мочку на 10 миллилитров свежего ДМЭМ с 10% FBS для удаления трансфекционного реагента. Инкубировать клетки в течение следующих 48 часов. Через 48 часов соберите супернатант с помощью 10-миллилитрового шприца и пропустите его через фильтр 0,45 микрометра.

Аликвот вирус супернатант и хранит его при минус 80 градусах Цельсия. Для определения титра вируса посеяли 5 миллионов клеток HEK293T на скважину в две шестискубойные пластины. Инкубировать обе пластины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ночи, чтобы достичь слияния от 50 до 60%.

На следующий день используйте одну из шести плит скважин для подсчета ячеек в шести скважинах. Разморозьте вирусную аликвоту, которая будет использоваться для выполнения последовательного разведения, и добавьте восемь микрограммов на миллилитр полибренового реагента, подготовьте DMEM с 10% FBS для серийного разведения вируса и добавьте полибренный реагент. Готовят два миллилитра десятикратного последовательного разведения лентивируса от 0,1 до 0,0001 в полибреносодержащих средах.

Удалите жиму из шестискубной пластины и добавьте один миллилитр вирусных разведений в скважины, оставив одну лунку только со средой в качестве отрицательного контроля, а другую с 100% вирусом. Инкубировать клетки в течение 24 часов. На следующий день удалите среду с вирусом из шестиямячковых пластин и замените ее на два миллилитра свежего ДМЭМ с 10% FBS.

Инкубируют клетки в течение 48-72 часов, наблюдая GFP с помощью флуоресцентного микроскопа каждый день. Через 48-72 часа отсоединяйте клетки и повторно суспендировать их в максимальном буфере. Используйте проточный цитометр для определения процента экспрессии GFP и расчета титра вируса по формуле, приведенной в текстовой рукописи.

Обложите интересующие клеточную линию 10-сантиметровой пластиной и инкубируют в течение ночи, чтобы достичь слияния от 50 до 60%, затем заражают клетки от 500 до 2000 микролитров вирусных частиц в 10 миллилитрах общего объема питательной среды. Инкубируют вирусные носители в течение 24 часов. На следующий день измените вирусные среды на культурную среду и определите процент положительных клеток GFP с помощью проточной цитометрии.

Выберите положительные ячейки GFP с помощью BD FACSAria II для сортировки ячеек. Разверните положительно выбранные ячейки и заморозьте запас. Положите положительно отобранные клетки и нетрансдуцированные клетки в 12-колодезные пластины отдельно, через 24 часа после заражения.

Подождите, пока клетки прикрепятся и изменят жиму на клеточную культурную жиму, содержащую 200 наномоляров Shield-1. Замените мочу в пластинах трансдуцированными и нетрансдуцированными ячейками, оставив две скважины на пластину с обычной средой в качестве отрицательного контроля. Инкубировать и извлекать белки из каждой скважины через ноль, два, шесть, 12, 24, 48 и 72 часа после добавления Щита-1 в скважины.

Затем удалите муляй с Shield-1 из остальных скважин и замените ее на обычную клеточную целлюлозу. Соберите белки из этих колодцев через два, шесть и 12 часов после смены среды. Индукция белка Cas9 была подтверждена тем, что его уровни экспрессии были сходными среди трансдуцированных клеток и транспортного средства, несмотря на наличие или отсутствие Shield-1.

Существует достаточная индукция экспрессии Cas9 в трансдуцированной клеточной линии A549 через два часа после лечения Щитом-1, которая становится незначительной в течение шести-12 часов после отмены Щита-1. Обработанные Shield-1 трансдуцированные клетки A549 уменьшились в количестве через 48 часов, не влияя на образец Rinella, который был подтвержден иммуноблоттингом с использованием антитела против обедненного белка RPA3. Инверсия редактирования генов или мутации инделя были подтверждены с помощью геодезизных нуклеазных анализов.

Разработанная конструкция вектора лентивируса представляла собой бицистроную систему, несущую другой ген, представляющий интерес под тем же промотором EF-1a. Модифицированный флуоресцентный белок, P2A, был добавлен к следам инфицированных клеток. Экспрессия белка mVenus наблюдалась в транспортных и трансдуцированных клетках A549, независимо от экспрессии DD-Cas9 и лечения Shield-1.

Эффективная трансдукция клеточной линии с вектором DD-Cas9 является одним из этапов ограничения скорости, поскольку наличие здоровых клеток HEK293T и использование их низкого числа проходов имеет решающее значение. Оптимизация соотношения между плазмидой DD-Cas9, упаковочной плазмидой и плазмидой оболочки очень важна для оптимальной трансфекции. Но помимо этого, также количество Shield-1, необходимое для стабилизации клеток-мишеней DD-Cas9, - это то, с чем вам нужно быть осторожным.

DD-Cas9 с плазмидой Cre также доступен, и его можно использовать для изучения генетических взаимодействий в исследованиях in vivo на основе системы Cre-lox.