Анализ проницаемости барьера кровяных мозговых клеток микробным обходом через микрососудистые эндотелиальные клетки

Этот метод позволяет анализировать гемово-мозговой барьер человека путем измерения бактериального обхода на различных методах лечения. Это может помочь обнаружить патогенез бактериального менингита и послеоперационный бред. Это простой метод и последствия лечения непосредственно представлены количество бактерий.

Он может быть изменен, чтобы обеспечить высокую пропускную способность анализа соединений на эндотелиальных клетках. Начните с сборки пластины из 12 колодец в шкафу биологической безопасности. Распаковать пластину и каждую вставку, а затем использовать стерилизованные типсы, чтобы захватить вставки у их основания и положить их в колодцы.

Пальто пористой мембраны каждой вставки с 90 микролитров 10 микрограммов на микролитр коллагена IV и фибронектина смеси и инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. После инкубации, мыть вставки в два раза путем пипетки один миллилитр PBS в каждой вставке и аспирации его с вакуумным насосом. Затем эквилибрировать мембраны путем трубопроводов довоенной DMEM F12 среды в верхней и нижней камерах и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.

Для семян микрососудистых эндотелиальных клеток человека, аспирировать среду из колбы клеточной культуры и мыть клетки с 10 миллилитров PBS. Обложка клетки полностью с пятью миллилитров трипсина EDTA и инкубировать колбу в течение трех-пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Перенесите пять миллилитров клеток в 15 миллилитровую трубку и добавьте пять миллилитров FCS, содержащих среду, чтобы остановить энзиматические реакции.

Центрифуга подвески в течение трех минут при 210 раз г, удалить супернатант и повторно клеточной гранулы в пять миллилитров среднего. Добавьте 10 микролитров клеточной подвески в 10 микролитров 0,4% трипана синего пятна, затем добавьте 10 микролитров смеси в счетную камеру. Поместите счетную камеру в счетчик ячеек и запустите соответствующую программу, убедившись, что счетчик сфокусирован.

После подсчета, семена 200000 клеток в каждой верхней камере на 12-хорошо пластины и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 14 дней изменения средств массовой информации в верхней и нижней палате каждые два-три дня. Через 14 дней убедитесь, что слияние клеток на 100% путем визуализации их с помощью микроскопа. За день до измерения проницаемости поместите одну колонию штамма E.coli GM2163 в три миллилитров среды LB.

Культура клеток при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов в инкубационный шейкер. Для лечения клеток с соединением интереса, разбавить его до окончательной концентрации в DMEM F12 среды и добавить эту смесь в верхней и нижней камер в 12-хорошо пластины, а затем инкубировать пластины в инкубаторе культуры клеток. После инкубации, обмен полной среде с антибиотиками свободной среде.

Определите концентрацию ночной бактериальной культуры, измерив ее оптическую плотность на 600 нанометров, затем разбавьте ее до OD600 из 0,5 в 50-миллилитровой трубке Falcon. В кабинет биологической безопасности добавьте 450 микролитров бактериального раствора в каждую верхнюю камеру пластины из 12 колодец, затем инкубировать пластину в течение шести часов при 37 градусах Цельсия. После инкубации снимите вставку с помощью типсов и отведать 50 микролитров среды из каждой нижней камеры, заботясь о том, чтобы не выплескить среду из верхних камер в нижние.

Важно строго отделить средства массовой информации верхней и нижней палаты, так как побочный эффект от бактерий верхней палаты приведет к ложноположительному результату. Брось каждый образец на отдельную агар-пластину и скоой раствор с помощью распределитель клеток. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов, а затем рассчитывать колоний.

Чтобы исследовать влияние гликации на микробный обход через геммоемафальный барьер, клетки лечились с 0,5 и 0,15 миллимолярского гликсалового раствора в течение одного часа с необработанными клетками, выступающей в качестве контроля. Затем гликация была обнаружена с помощью иммуноблотинга с антителами против AGE. Полученные бактериальные колонии были подсчитаны и представлены как абсолютное количество колоний или относительное количество колоний, нормализованных к контролю.

Образцы, обработанные глиоксалом, показали увеличение количества колоний, указывающих на то, что лечение влияет на плотность клеточного барьера. Для исследования глюкозно-индуцированной гликации белка, THBMECs культивировались в нормальной глюкозы и высокой глюкозы среды. Абсолютное количество колоний и относительное количество колоний, нормализованных до контроля, показали, что глюкоза не имеет существенного влияния на целостность гем blood-brain barrier.

Обработанные эндотелиальные клетки могут быть дополнительно проанализированы протеомическими подходами, например масс-спектрометрией, для анализа изменений в протеоме. Этот метод помогает в понимании гемово-мозгового барьера человека и бактериального обхода. Он может быть использован для обнаружения аспектов старения и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.