Количественная оценка размера печени в Larval Зебрафиш Использование Brightfield микроскопии

Этот метод обеспечивает способ количественного размера печени в личинки зебры. Он также позволяет оценить влияние генетических и фармакологических манипуляций на рост и развитие печени. Этот метод обеспечивает быстрый и точный способ визуализации и измерения печени, а также кишечника и поджелудочной железы.

В дополнение к количественной оценки размера печени, этот метод вскрытия может быть полезным для подготовки печени, кишечника и поджелудочной железы для гибридизации на месте или конфокальных изображений. Перед попыткой deskinning на экспериментальных личинок, убедитесь, что вы потратили достаточно времени практикующих на не-экспериментальных образцов и имеют значительный успех. Очень важно визуализировать надлежащую ориентацию и движение личинок зебры и типсов, чтобы удалить кожу, не нарушая окружающих органов.

В течение трех-семи дней после оплодотворения, после усыпения личинок, используйте стеклянную пипетку и пипетку насос для сбора до 15 личинок в двух миллилитровой трубке. Вымойте личинки дважды с одним миллилитром холодного 1X PBS на льду. Удалите как можно больше PBS с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса и добавить один миллилитр холодных четыре процента PFA в PBS.

Инкубировать при четырех градусах по Цельсию по крайней мере на ночь с нежным качания. Используя стеклянную пипетку и пипетку насоса, удалить PFA из трубки и промыть три раза с одним миллилитров холодного PBS. Рок в течение пяти минут между полосканиями.

Pipette несколько личинок в PBS в один колодец из девяти хорошо круглое дно стеклянное блюдо. Под микроскопом удалите кожу, окружающую печень, используя тонкие миппы, чтобы держать одну личинку на спине, сжимая по обе стороны головы как можно мягче. Затем используйте очень тонкие миппы в другой руке, чтобы захватить кожу просто чрезмерно сердце.

Потяните кожу вниз по диагонали к хвосту рыбы в нижней части блюда на левой или правой стороне рыбы. Повторите для другой стороны. Продолжить захвата закрылки кожи и потянув вниз, пока все кожи и меланофоров чрезмерно или вблизи печени были удалены.

Если желток присутствует в течение пяти-шести дней после оплодотворения личинок, поднимите желток в один кусок, держа рыбу с тонкой типсов на спине и с помощью очень тонкой типсов мягко подталкивать желток. В течение трех-четырех личинок DPF держите рыбу с тонкой типсом на спине и используйте очень тонкие миппы, чтобы погладить желток, начиная с брюшной стороны. Очисти желток на куски.

Поместите расчлененные личинки в свежий, холодный PBS в двухми миллилитровую трубку с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса. Чтобы смонтировать личинки, налейте несколько миллилитров трехпроцентной метилцеллюлозы на крышку чистой пластиковой чашки Петри. Используйте стеклянную пипетку и пипетку насоса, чтобы добавить личинки метилцеллюлозы, добавив как можно меньше PBS с личинками, как это возможно.

Под рассечением микроскопа при низком увеличении, использовать тонкие миппы, чтобы сориентировать рыбу, чтобы они лежали на правой стороне лицом влево. Подтвердите, что рыба, которую нужно сфотографировать, идеально выравнивается одним глазом прямо на другой глаз. Если хвост рыбы согнут, удалите хвост, сильно ущипнув его щипами, чтобы удалить его так, чтобы рыба лежит ровно.

Увеличьте масштаб до высокого увеличения и сосредоточьтесь на печени, убедившись, что контур печени хорошо виден. Нажмите кнопку Capture Image, чтобы привязать картинку и сохранить файл. Повторите для всех рыб, убедившись, что увеличение является одинаковым для каждой картины.

Смойте микрометр с помощью того же увеличения. Чтобы использовать программу R, чтобы ослепить все изображения печени, чтобы избежать потенциальной предвзятости следователя и содействовать научной строгости, переименовать файлы случайным образом и создать файл рандомизации, содержащий список исходных имен файлов и соответствующих ослепленных имен файлов. Откройте рандомизированные файлы в порядке, начиная с файла 1.

Выберите инструмент Freehand Selections и наметите каждую печень. Пресс-контроль-М для измерения области каждой печени. Для любых печени, которые не могут быть точно измерены, потому что они имеют остаточную кожу, желток, находятся вне фокуса, или не нетронутыми, вставьте измерения заполнителя.

Сохраните измерения в текстовом файле. Чтобы не прислепить и проанализировать данные, откройте файл измерений и файл рандомизации в электронной таблице программы. Вставьте новую колонку в файл измерений и добавьте исходные имена файлов для ослепительных файлов с помощью файла Рандомизации.

Сохраните этот файл в качестве файла Unblinded Measurements. Сортировать данные по исходному имени файла. Исключите любые измерения печени, для которых фотографии не были адекватными.

При необходимости преобразуем значения измерений в нужную шкалу в квадратные миллиметры. Откройте планку scale в программном обеспечении для обработки изображений. Используйте инструмент «Прямая линия» для измерения одного миллиметра на строке шкалы.

Программное обеспечение обработки изображений затем измеряется в тех же единицах, что и печень, что дает коэффициент конверсии. Используйте коэффициент преобразования для преобразования измерений в файле Unblinded Measurements. Определите среднее и стандартное отклонение и вычислите P-значения.

В течение шести дней после оплодотворения, не-трансгенных личинок зебры показали естественное положение и форму печени чрезмерно кишечника. Трансгенные зебры значительно увеличили размер печени по сравнению с их не трансгенными братьями и сестрами. Здесь показаны некоторые примеры неадекватных изображений и микрометра.

Личинка с кожей, покрывающей печень, личинка с желтком, заслоняющим печень, личинка с частями печени ущипнула, а личинка с вывихнутой и падающей печенью, личинка с отсутствуют печенью, личинка с контуром печени, которую трудно определить, и личинка с неправильным позиционированием. При попытке этой процедуры, важно использовать небольшие и контролируемые движения, чтобы предотвратить повреждение печени. В дополнение к ярко-полевой микроскопии, мы также можем использовать личинки, расчлененные таким образом, для конфокаляций, для визуализации флуоресцентных белков репортера или иммунофлуоресцентного окрашивания, а также для гибридизации на месте.

Формальдегид или ПФА является раздражающим и подозреваемым канцерогеном. Перчатки следует носить при обработке PFA и концентрированные решения должны быть обработаны в химическом капоте дыма.