Количественная оценка уровней этанола в эмбрионах зебрафиш с использованием хроматографии космического газа головы

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он помогает в понимании фармакокинетики этанола в разработке эмбрионов зебры, и это поможет стандартизировать режимы воздействия этанола в исследованиях зебры. Основным преимуществом нашей техники является то, что она позволяет исследователям быстро и воспроизводимо измерять уровень этанола во время эмбрионального развития, особенно в эмбрионах, где кровоснабжение отсутствует. Этот метод может быть легко применен к другим модельм систем, а также другие факторы окружающей среды при условии надлежащей техники и установки оборудования.

Я ожидаю, что люди, выполняющие этот протокол в первый раз бороться со скоростью, необходимой для предотвращения испарения этанола во время обработки эмбрионов. Начните с переноса 10 эмбрионов с дополнительной эмбриональной жидкостью в 1,5 миллилитровые микроцентрифуги, отмеченные линией объемом 250 микролитров. Добавить воду в линию заполнения.

Подготовь дополнительные микроцентрифуговые трубки для дехорионированных образцов. Чтобы удалить хорион, инкубировать эмбрионы в 100 миллиметров Петри блюдо с двумя миллиграммами на миллилитр протеазы коктейль в эмбрионе средств массовой информации в течение 10 минут. Аккуратно закружить блюдо каждые несколько минут, чтобы сломать хорион.

Как только все эмбрионы будут свободны от хориона, удалите их из коктейля протеазы и дважды вымойте свежими средствами массовой информации. Затем перенесите эмбрионы в свежую 100-миллиметровую тарелку. Когда все образцы будут готовы к измерению объема, используйте микропайпет P200 с самым маленьким наконечником можно тщательно удалить всю жидкость со всего эмбриона.

Взвесить воду по шкале с точностью менее 0,1 миллиграмма, а затем определить объем 10 эмбрионов, вычитая вес удалены воды из 250 микролитров. Чтобы определить объем одного эмбриона, разделите разницу на 10. Соберите эмбрионы из брачных резервуаров и поместите их в стандартную 100-миллиметровую чашку Петри, затем инкубировать блюдо при 28,5 градусах по Цельсию.

На шесть часов после оплодотворения, передать до 100 эмбрионов в новое блюдо с эмбрионом средств массовой информации и 1%этанола или средств массовой информации в одиночку. Обложка, но не запечатать чашки Петри и поместить их в 28,5 градусов по Цельсию инкубатор в течение 18 часов или до тех пор, пока они достигают 24 часов после оплодотворения. Используйте два микропипта P200, установленных на 50 микролитров, и аспирировать раствор коктейля протеазы в один и воду во второй.

Затем быстро поместите 10 эмбрионов в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку с помощью стеклянной пипетки и закройте крышку. Повторите этот процесс для всех образцов, которые будут протестированы, контроля и этанола обработанных эмбрионов. Работая с одним образцом за один раз, быстро откройте крышку и аспирировать все остаточные эмбриональные средства с микропипертом P200, установленным на 200 микролитров.

Быстро, но осторожно добавить и удалить 50 микролитров воды, затем добавить 50 микролитров коктейля протеазы и закрыть крышку трубки. Пусть образец сидеть в течение 10 минут при комнатной температуре, то быстро добавить 450 микролитров пяти хлорида натрия моляра и закрыть крышку трубки. Гомогенизировать образец путем вихря в течение 10 минут и передачи двух микролитров супернатанта в газовый хроматографический флакон.

Печать флакона с полиэтиленовой крышкой. После завершения метода запуска загрузите 436 текущих SPME этанола от двух до пяти минут RG перспективе. метамфетамин из меню методов в программном обеспечении анализа для каждого образца в списке образцов.

Заполните список образцов, начиная с воздуха, воды и пяти молярных хлорид натрия протеазы коктейль пробелы. Затем введите стандарты этанола в порядке от 0,3125 до 40 миллимолей. Следуйте стандартам со вторым раундом пробелов.

Введите все однородные образцы супернатантов эмбрионов, которые будут протестированы от самой низкой до самой высокой прогнозируемой концентрации этанола и закончить, введя третий раунд пробелов. Добавьте газовые хроматографические флаконы в автосамплер в том порядке, в котором были введены образцы, и дайте им прогреться в течение 10-15 минут. Затем запустите пример работает с помощью программного обеспечения.

После завершения всех запусков активируйте метод выключения, добавив окончательный образец в список образцов и вытехав standby.meth. Резервное время всех данных, полученных во время пробного запуска. Как только метод выключения завершен, нажмите на открытую хроматограмму и откройте папку с результатами.

Образцы автоматически интегрируются в эту программу. В результатах убедитесь, что правильные пики были интегрированы. После того, как все образцы были подтверждены, распечатать или экспортировать результаты.

Участок пиковой высоты стандартов этанола на графике, а затем рассчитать склон, y-перехват, и r квадратных значений. Получить значение этанола для каждого образца путем вычитания пиковой высоты образца из у-перехвата стандартов и деления этого значения на наклон стандартов. Для расчета концентрации этанола в эмбрионах вычислите коэффициент разбавления для каждого образца и умножьте значение образца этанола с помощью этого фактора разбавления.

Наконец, вычислите образцы ссылок на средства массовой информации путем умножения значения медиа-этанола на коэффициент разбавления в 10. Для правильного расчета концентрации эмбрионального этанола измерялись объемы эмбрионов как в хорионе, так и при их удалении из хориона. В этом анализе, эмбрион составил 56% от общего объема внутри хориона.

На основе ранее опубликованных работ, 73,6% было использовано в качестве эмбрионального содержания воды для всех представленных анализов. В результате вода составила 0,82 микролитера 1,1 микролитров эмбрионального объема. Из общего объема воды 49% содержится в эмбрионе и 51% - во внеэмбрионной жидкости.

Для анализа газовой хроматографии были проанализированы две группы из 15 образцов и средства массовой информации, с помощью которых они были обработаны, измеренные пять раз на группу. Уровни медийного этанола были 143,6 миллимоляра для группы 1 и 133,6 миллимолара для группы 2. Концентрации этанола эмбрионов в среднем 63,5 миллимоляра и 53,1 миллимолара для групп один и два соответственно.

Было рассчитано соотношение концентрации эмбрионального этанола к медиа-уровням этанола для каждой выборки. В первой группе было 44% уровней медиа-этанола, в то время как у группы было 40% уровней медиа-этанола. Необработанные контрольные эмбрионы измерялись при нулевой концентрации миллимолярского медийного этанола.

Самое главное помнить при попытке этой процедуры является то, что обработка эмбрионов для анализа GC правильно имеет решающее значение, как этанол летучих и будет быстро испаряться. Лучший способ выполнить этот шаг описывается, но это должно быть на практике для развития надлежащей мышечной памяти. Эта процедура поможет стандартизировать режимы лечения этанола у зебры и позволит в будущем работать, чтобы вскрыть генетические и клеточные механизмы этанальной тератогенности.