Dextran маркировки и поглощения в живых и функциональных Murine кохлеарных волосяных клеток
8 февраля 2020 г.
Здесь мы представляем метод визуализации поглощения 3 kDa Техас Красная маркировка dextran в слуховых волосяных клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Кроме того, декстран т 3-10 кДа может быть использован для изучения эндоцитоза волос и поддерживающих клеток органа Корти.
Общая цель этого протокола заключается в изучении поглощения регулярных декстран флуоресцентно помечены Техас Красный в живых волосковых клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Основным преимуществом этой техники является то, что три килодалтона Texas Red dextran могут быть использованы для оценки функции механотрансдукционных каналов в живых волосяных клетках. Чтобы собрать улитку, поместите череп послеродовой день шесть мыши в 60 миллиметров культуры блюдо, содержащее L-15 среды Лейбовица и использовать хирургические ножницы, чтобы сделать поверхностный разрез от переднего конца до заднего конца черепа и через внешние слуховые каналы.
Сложите кожу к носу, чтобы разоблачить череп и сделать разрез от задней части до передней части черепа и через линию глаза. Разделить череп на две половины и использовать небольшой шпатель, чтобы удалить мозг. Когда височные кости можно наблюдать, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать вокруг этих костей, чтобы акциз ткани.
Погрузите височные кости в 35-миллиметровую тарелку, содержащую свежую среду L-15, и поместите блюдо под стерео микроскоп, оснащенный широким полевым окуляром и внешним чередующимся источником галогенного света. Используйте типсы для удаления окружающих кохлеарных тканей, полукруглых каналов и вестибулярных органов. После того, как улитка была вскрыта и помещена в новое блюдо со свежими L-15 сми, использовать хирургические типсы, чтобы сделать один прокол раны на круглое окно и один прокол в апической кохлеарный регион.
Когда все улитки были собраны, поместите ткань в колодец из девяти хорошо стеклянной пластины депрессии, содержащей 200 микролитров свежей L-15 среды. Для декстранной маркировки изолированных тканей замените среду из каждого образца хорошо с 200 микролитров свежей L-15 среды дополнены двумя миллиграммами на миллилитр флуоресценции конъюгированных декстран интереса. Инкубировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре и 25 оборотов в минуту в трехмерном шейкере под наклонным углом 25 градусов, защищенном от света.
В конце инкубации, мыть ткани один раз со средним и один раз с HBSS в течение двух минут за стирку. После второй стирки, исправить образцы в 4%paraformaldehyde в течение 30 минут при комнатной температуре следуют два быстрых и нежных моет в HBSS. После второй стирки используйте тонкие миппы кончика, чтобы удалить кохлеарную кость, спиральную связку и текториальную мембрану и промыть изолированный орган Корти в HBSS.
Будьте особенно заботы при удалении прозрачной текторной мембраны, так как ткань на волосковых клетках может быть легко повреждена во время этого шага. Чтобы маркировать F-актин, пронизывают образцы в 0.5%Triton X-100 в PBS дополнены от 100 до 200 разбавления флуоресцентно помечены фаллоидин в течение 30 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть ткани два-три раза в свежем HBSS за стирку, как попродемонстрировано следуют одной стирки в PBS.
Используйте соответствующую монтажную среду для установки органа тканей Корти на стеклянный микроскоп слайды волос стереоцилия сторон вверх и изображение образцов на флуоресцентный конфокальный микроскоп с помощью 63X цели погружения масла. После двухчасовой инкубации с трехкилограммовым декстраном флуоресцентно спрягается с Texas Red, орган Corti explant из дикого типа послеродового дня шесть мышей демонстрируют надежную и специфическую маркировку как внутренних, так и внешних волосковых клеток. Изображение стереоцилии волосяных клеток и клеточных тел показывает, что только те клетки, которые включили три килодальтон dextran Texas Red в их клеточном теле, также продемонстрировали флуоресцентную маркировку их стереоцилии.
Важно отметить, что единый флуоресцентный сигнал наблюдается вдоль стереоцилии с обогащением на кончиках коротких стереоцилий рядов, где находится канал механотрансдукции. Vesicle-как структуры в клеточном теле волосковых клеток и соседних вспомогательных клеток также наблюдается предполагая, что декстран Техас Красный также может быть принято эндоцитоз. Большие 10 килодальтон dextrans также производится пузырьков, как картина в клеточном теле волосковых клеток и вспомогательных клеток.
Примечательно, что наличие хелатора кальция или блокаторов механотрансдукционного канала предотвращает маркировку стереоцилий и поглощение трех килодальтонного декстрана Texas Red в волосяных клетках. Однако везикулярная модель по-прежнему наблюдается при наличии блокады канала механотрансдукции, что указывает на то, что эта модель поглощения не зависит от функциональных каналов MET. Очень важно тщательно вскрыть орган ткани Корти и подтвердить правильную ориентацию волосковых клеток перед монтажом ткани для визуализации.
После декстранной маркировки живых и функциональных волосковых клеток, иммуностеть фиксированной ткани может быть выполнена для выявления конкретных типов клеток белков, представляющих интерес.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод визуализации поглощения декстрана с меткой Texas Red (3 кДа) слуховыми волосовидными клетками с функциональными механотрансдукционными каналами. Этот метод позволяет оценить функцию механотрансдукционных каналов в живых волосовидных клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Исследования слуха
Теоретическая часть
- Понимание механизмов механотрансдукции в волосковых клетках слуха имеет решающее значение для функционирования слуха.
- Декстраны различного размера могут быть использованы для изучения таких клеточных процессов, как эндоцитоз.
- Орган Кортеуса является ключевой структурой улитки, участвующей в процессе слуха.
- Флуоресцентное мечение помогает визуализировать процессы клеточного захвата.
Цель исследования
- Для визуализации захвата декстрана, меченого Texas Red, в живых волосовых клетках слухового аппарата.
- Для оценки функциональности механотрансдукционных каналов в этих клетках.
- Для изучения возможности применения декстранов при исследовании эндоцитоза в волосовых и поддерживающих клетках.
Используемые методы
- Выделение улитки мышей на шестой день после рождения.
- Использование хирургических методов для обнажения структур улитки.
- Нанесение декстрана, меченного Texas Red, на волосковые клетки слухового анализатора.
- Визуализация поглощения с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная визуализация поглощения декстрана живыми волосковыми клетками.
- Демонстрация функциональности механотрансдукционных каналов.
- Получение новых данных о механизмах эндоцитоза в улитке (органе Корти).
- Разработка надежного метода изучения биологии слуховых клеток.
Выводы
- Данный метод позволяет эффективно визуализировать поглощение декстрана волосковыми клетками слухового анализатора.
- Этот подход может углубить понимание механизмов механотрансдукции при слуховом восприятии.
- В будущих исследованиях данный метод может быть использован для изучения смежных клеточных процессов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для данной отрасли
Оценка функции каналов механотрансдукции в живых слуховых волосковых клетках имеет решающее значение для валидации мишеней при разработке методов лечения потери слуха. Данный метод обеспечивает прямой количественный анализ активности каналов посредством поглощения флуоресцентного декстрана, что позволяет снизить механические риски при работе с мишенями, участвующими в сенсорной трансдукции. Этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, связывая молекулярную функцию с клеточным фенотипом в системе, релевантной данной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямого измерения функциональной активности механотрансдукционных каналов в живых волосковых клетках.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков при выборе мишеней благодаря надежному методу анализа функции каналов на основе визуализации.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля соединений, позволяя отличить вещества, которые сохраняют или модулируют функцию MET-каналов, от тех, которые этого не делают.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем подтверждения MET-зависимого поглощения декстрана в качестве функционального биомаркера.
- Количественные данные: Получение измеримых сигналов флуоресценции в стереоцилиях и теле клетки, которые коррелируют с активностью каналов и могут быть нормализованы по всем образцам.
- Масштабируемость и повторное использование: Возможность адаптации платформы для высокопроизводительного анализа кинетики поглощения красителя в эксплантах улитки (органа Корти).
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: использование эксплантатов органа Корти мышей постнатального периода в качестве релевантной модели для изучения функции слуховых волосковых клеток.
- Трансляционная преемственность: обеспечение связи между результатами фундаментальных исследований и доклинической валидацией за счет получения стабильных показателей активности MET-каналов на разных этапах экспериментов.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: обоснование решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем выявления соединений, которые блокируют поглощение декстрана за счет ингибирования MET-каналов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска — от проверки гипотезы о мишени до идентификации ведущих соединений, где функциональная валидация механотрансдукционных каналов предшествует скринингу и оптимизации соединений.
- Открытие в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая прямое считывание клеточного захвата, зависящего от MET-каналов в волосковых клетках.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря стандартизированным протоколам мечения декстраном, которые позволяют получать воспроизводимые количественные показатели флуоресценции в стереоцилиях и теле клетки.
- Аналитика: предоставляет измеряемые зависимые переменные (интенсивность флуоресценции в рядах стереоцилий и везикулоподобные паттерны), что позволяет сравнивать экспериментальные условия и эффекты соединений.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, используя тот же метод считывания активности MET для оценки взаимодействия с мишенью в моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования метода оценки функции сенсорной трансдукции в различных программах исследований слуха.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишени за счет уменьшения механистической неопределенности в анализе путей механотрансдукции.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря определенным параметрам инкубации, промывки и визуализации поглощения декстрана.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений «продолжать/прекратить» (go/no-go) путем установления связи между модуляцией мишени и функциональными показателями волосковых клеток, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию соединений с учетом рисков, основываясь на их влиянии на MET-зависимое поглощение декстрана в релевантной для заболевания системе.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения диссекции улитки мыши, изоляции кортиева органа и использования флуоресцентной микроскопии.
- Зависит от инфраструктуры конфокальной визуализации с соответствующими настройками лазера и детектирования флуоресценции Texas Red.
- Необходимо стандартизировать концентрацию декстрана, время инкубации и условия встряхивания в разных лабораториях.
- При применении метода к другим моделям млекопитающих или на разных стадиях развития требуются определенные адаптации.
- Ограничено необходимостью подготовки живых тканей и чувствительностью волосковых клеток к механическому и экологическому стрессу во время диссекции.
